ניתוח מיקרוסקופי של סינפסות בפרוסות היפוקמפוס של עכבר באמצעות אימונופלואורסצנציה

Abstract

מקור: McLeod, F., et al. הערכת צפיפות הסינפסה בפרוסות מוח של מכרסמים בהיפוקמפוס. J. Vis. Exp. (2017).

סרטון זה מדגים שיטה להמחשת סמנים סינפטיים בפרוסות מוח בהיפוקמפוס באמצעות ניתוח אימונופלואורסצנטי קונפוקלי. הפרוסות מוכתמות במערכת החיסון בנוגדנים ראשוניים המכוונים לסמנים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים, ואחריהם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור. הסמנים המסומנים מוצגים לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית כדי להעריך את הארכיטקטורה הסינפטית באמצעות הקו-לוקליזציה שלהם.

Protocol

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. הכנת פרוסת היפוקמפוס חריפה

הסר את מוח העכבר במהירות האפשרית, בעזרת מרית ומספריים חדים כדי לחתוך את הגולגולת, והנח אותו בנוזל מוחי מלאכותי קר כקרח, מחומצן (95% O₂, 5% CO₂), נוזל מוחי מלאכותי עתיר סוכרוז (ACSF, ~100 מ"ל).

2. הניחו את מוח העכבר על צלחת פטרי והסירו את המוח הקטן וחלק קטן מקליפת המוח הקדמית בעזרת אזמל לפני שחותכים במורד קו האמצע של המוח.
3. הניחו את שתי ההמיספרות בצד שזה עתה נחתך והדביקו כל המיספרה על הבמה של ויברטום.
4. Cut 200 - 300 μm חלקים בעובי של כל אזור העניין. במקרה של ההיפוקמפוס, יש להשיג כ 3 - 4 פרוסות לכל חצי כדור.
5. בעזרת פיפטה פסטר מפלסטיק, העבירו את הפרוסות לתא שקוע ב-ACSF מחומצן (95% O₂, 5% CO₂). יש לשמור על טמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
   הערה: בשלב זה, ניתן לטפל בפרוסות עם חומרים פרמקולוגיים פעילים, כגון חלבוני Dickkopf-1 רקומביננטיים (Dkk1), על ידי הוספת החומרים לתא הפרוסות.
6. בעזרת מברשת, הוציאו את הפרוסות מהתא, הניחו אותן בצלחת של 24 בארות וקבעו אותן למשך 20 דקות עד שעה ב-4% פרפורמלדהיד (PFA)/4% סוכרוז בטמפרטורת החדר (RT).
   זהירות: PFA רעיל, ללבוש הגנה מתאימה.
7. שטפו את הפרוסות שלוש פעמים בתמיסת מלח 1X עם חוצץ פוספט (PBS, 10 דקות כל אחת).
   הערה: ניתן להשהות את הפרוטוקול כאן למשך 1-2 ימים, כל עוד הפרוסות נשמרות ב-4 מעלות צלזיוס ב-1X PBS.

2. Immunofluorescence for Synaptic Markers

הערה: ניתן למצוא את המתכונים של כל המאגרים המשמשים בטבלה 1.

1. בבארות הפרוסות, החלף את ה-PBS במאגר חוסם/חדיר (טבלה 1) ודגר ב-RT למשך 4 - 6 שעות.
2. יש לדלל את הנוגדן הרב-שבטי של שרקנים כנגד טרנספורטר גלוטמט שלפוחית 1 (vGlut1) בדילול של 1:2,000 במאגר חסימה/חדירה.
   הערה: vGlut1 הוא סמן להדמיה טרמינלית מעוררת קדם-סינפטית. לזיהוי סינפסה מעוררת פוסט-סינפטית, השתמש בנוגדנים רב-שבטיים כנגד צפיפות פוסט-סינפטית-95 (PSD-95) ודלל 1:500 באותה תמיסה. השתמש בנפח מינימלי של 300 מיקרוליטר בכל באר. כדי לזהות את המיקום האנטומי של ההיפוקמפוס, השתמש בנוגדנים שיכולים לזהות גם את המבנה העצבי, כגון חלבון 2 הקשור למיקרו-צינוריות (MAP2) או טובולין. חשב את הריכוזים הנכונים של כל הנוגדנים העיקריים לסמנים הסינפטיים לבחירה (קדם ופוסט סינפטי) ודלל במאגר חוסם/חדיר טרי.
3. דגרו את הפרוסות בתמיסת הנוגדנים העיקרית למשך הלילה (או למשך 1-2 ימים) בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
4. שטפו את הפרוסות שלוש פעמים ב-PBS (10 דקות כל אחת).
5. יש לדלל את הנוגדנים המשניים המתאימים 1:500 במאגר החוסם. לדוגמה, בעת שימוש בנוגדנים vGlut1 לשרקנים, יש למרוח נוגדן משני המזהה את מרכיב השרקנים (למשל, חמור נגד שרקנים) המצומד לפלואורופור ספציפי. בעת שימוש בנוגדני ארנב PSD-95, יש למרוח נוגדן משני המזהה את מרכיב הארנב (למשל, אנטי ארנב חמור) המצומד לפלואורופור ספציפי אחר.
6. דגרו את הפרוסות בתמיסה זו למשך 2-3 שעות ב-RT. ודא שהפרוסות מוגנות מפני האור, מכיוון שהנוגדנים המשניים רגישים לאור.
7. שטפו את הפרוסות שלוש פעמים ב-PBS (10 דקות כל אחת).
8. הסר בזהירות את הפרוסות מצלחת 24 הבארות בעזרת מברשת צבע והנח אותן באופן שווה על שקופיות זכוכית מסומנות מראש. הוסף טיפה של מדיום הרכבה על גבי כל פרוסה ולאחר מכן הניח בעדינות כיסוי זכוכית על גבי הפרוסות. הימנע מהיווצרות בועות אוויר. הקפד להשתמש באמצעי הרכבה מספיק (300-400 מיקרוליטר), מכיוון שכמות לא מספקת עלולה להוביל לפרוסות יבשות.
9. השאירו לייבוש למשך 1-2 ימים לפחות ב-RT ושמרו על השקופיות מוגנות מפני אור.
10. אחסן את השקופיות ב-4 מעלות צלזיוס בטווח הקצר, אך לאחסון לטווח ארוך, שמור אותן ב-20 מעלות צלזיוס.

3. Confocal Image Acquisition and Analysis

1. הדמיה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי.
   1. זהה את האזור בהיפוקמפוס שיש לצלם (למשל, ה-cornu ammonis 1 ו-3 (CA1, CA3) או הפיתול המשונן (DG)) באמצעות מטרה של פי 10 או פי 20.
   2. שנה למטרה של טבילת שמן פי 40 או פי 63 כדי לוודא שהאנטומיה של הפרוסה שלמה על ידי זיהוי נויריטים רציפים ומבנה מאורגן. השתמשו בסמן עצבי, כמו למשל MAP2, כנקודת התייחסות (איור 1A).
   3. לאחר מכן, עבור ליעד טבילה בשמן פי 60 (צמצם מספרי [NA] = ~1.3 - 1.4) והתאם את ההגדרות עבור כל ערוץ כדי להשיג אות וניגודיות אופטימליים. השתמש באפשרות ניגודיות גבוהה/נמוכה כדי להגדיר את העוצמה של כל לייזר כדי למנוע רוויה של פיקסלים כלשהם.
      הערה: הגדרות אלו יהיו תלויות במיקרוסקופ בו נעשה שימוש, אך עיין בטבלת החומרים להגדרות עוצמת הלייזר. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש ברזולוציה של 1024 x 1024 פיקסלים. ההגדרות צריכות להישאר קבועות לאורך כל התנאים השונים של אותו ניסוי. ניתן להחיל זום נוסף במידת הצורך.
   4. הערך את העומק שבו הצביעה אחידה ורכוש ערימות תמונות של לפחות 8 מישורים במרחקים שווים (250 ננומטר). לאחר מכן קח 3 ערימות תמונות מייצגות סמוכות מאותו אזור עניין לכל פרוסה.
      הערה: העומק עשוי להשתנות מפרוסה אחת לאחרת אך תמיד צריך להיות כ-2 - 5 מיקרומטר מפני השטח של הפרוסה.
   5. חזור על הרכישה ב-3 פרוסות לפחות לכל מצב ומ-6 - 8 בעלי חיים לכל קבוצת טיפול.

טבלה 1: מאגרים המשמשים לצביעה אימונו-פלואורסצנטית.

PBSKCl KH₂PO₄

מאגר חוסם/חדיר	Concentration	Notes
donkey serum	10%
Triton-X	0.50%	<
1x
10x PBS		pH to 7.4
NaCl	1.37 M	<
27 mM
NaH2PO4	100 mM
18 mM		4% PFA/4% Sucrose		pH to 7.4
PBS	1x	דילול מ-10x
PFA	1.33 M
Sucrose	117 mM

td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'><td style='border:1pt solid #000000;padding:5pt;vertical-align:top;'>

Results

טבלה 1: מאגרים המשמשים לצביעה אימונו-פלואורסצנטית.

מאגר חוסם/חדיר

Materials