1. הכנת פרוסות אורגנוטיפיות
} הערה: מתכון זה משתמש בשני גורי עכברים ביום 7-9 לאחר הלידה (עמ' 7-9), ומניב 24 פרוסות אורגנוטיפיות המחולקות לשתי מנות תרבית של שש בארות. אלא אם צוין אחרת, יש לבצע את כל ההליכים במכסה מנוע סטרילי, ולהשתמש בכפפות ניטריל או לטקס. יש להשתמש רק במרכיבים בדרגת תרבית תאים.
- להכנת הפרוסות נעשה שימוש בבקבוקי חיטוי, כלי חיתוך (1 מספריים גדולים, 1 מספריים קטנים, 1 מרית שטוחה גדולה, 1 מרית קטנה מעוגלת ומושחזת ו-1 מלקחיים; ראו רשימת חומרים לפרטים), פיפטות זכוכית, קצות פיפטות ומגבוני טישו שימשו להכנת הפרוסות.
- מכיוון שיש להשתמש במחצית מפיפטות הזכוכית עם הפתח הגדול, נתק את הקצה הצר.
- קלעו עם עט סופר יהלום (אם זמין) סביב הפיפטה ממש מתחת לנקודה שבה הזכוכית מתחילה להצטמצם. לאחר מכן, הניחו את הקצה המחודד של הפיפטה לתוך כפפת ניטריל או דומה. שברו בזהירות את הקצה על ידי כיפוף הפיפטה תוך כדי דחיפתה אל שולחן עבודה.
- לאחר מכן, הקהה את הקצה השבור על ידי שפשוף על פיסת נייר זכוכית או המיס אותו מעט על מבער בנסן. הפיפטות השבורות משמשות להעברת פרוסות מוח חתוכות, כאשר הקצה השבור הופך לנורת הגומי והקצה הפתוח הגדול נוגע בתמיסה/פרוסות.
הערה: זה לא נעשה במכסה מנוע סטרילי וניתן לעשות זאת מספר ימים מראש.
- הכינו מנות תרבות.
הערה: ניתן לעשות זאת יום לפני החיתוך או לפחות שעתיים לפני החיתוך. - לעקר ממברנות פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) ("קונפטי"). השתמש בשני מלקחיים סטריליים כדי להסיר קונפטי בודד מחתיכות הפלסטיק הכחולות שמסביב. לאחר מכן, יש לעקר על ידי טבילה פעמיים בצלחת פטרי המכילה 96% אתנול (EtOH). לאחר מכן, הניחו את הקונפטי שטוח בצלחת פטרי גדולה וסטרילית לייבוש.
הערה: הקונפטי הם ממברנות PTFE הידרופיליות הדומות לממברנות בתוספות התרבית. השימוש בקונפטי מסייע להדמיה חיה מכיוון שניתן להעביר בקלות פרוסות בודדות מהתוסף למערך המיקרוסקופ על ידי הרמת הקונפטי בעזרת מלקחיים (ראה 4.8. לפרטים). לחלופין, ניתן לתרבת את פרוסות המוח ללא הקונפטי (שבו הפרוסות יתחברו ישירות לקרום של תוספת התרבית). במקרה זה, יש לחתוך את תוספת הממברנה בעזרת אזמל כדי להעביר את הפרוסה לאמבט המיקרוסקופ. - הוסף 1 מ"ל של מדיום תרבות לכל באר מכלי התרבות של שש הבארות.
- מניחים תוספת תרבות אחת בכל באר בעזרת מלקחיים סטריליים. הימנע מבועות אוויר בין התוספת למדיום התרבית.
הערה: כדי לחסוך כסף וסביבה, אפשר לעשות שימוש חוזר בתוספות התרבית. ניתן לעשות זאת על ידי שטיפה יסודית במים מזוקקים (dH2O) ולאחר מכן דגירה ב-70% EtOH למשך 24 שעות לפחות עד לשימוש חוזר. כאשר מתכוננים לתרבית חדשה, יבשו את התוספות בצלחת תרבית תאים באור אולטרה סגול (UV) למשך 15-30 דקות. - הניחו שני קונפטי (מעוקרים ויבשים) על כל אחת מתוספות התרבית. מניחים את הקונפטי לכיוון שולי התוספות כדי לקבל חפיפה מינימלית.
- הכניסו את הצלחות לאינקובטור תרבית התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.
- Bubble cold dissection medium with bioxide gas (95% O2/5%CO2). כדי לשמור על התמיסה סטרילית, חבר את הצינור מבלון הגז למסנן מזרק סטרילי (גודל נקבוביות 0.22 מיקרומטר).
- חבר את הקצה השני של מסנן המזרק לצינור סטרילי המחובר לפיפטה מזכוכית סטרילית. הניחו את פיפטת הזכוכית בתמיסה, כסו אותה בפרפילם והדליקו את הגז. שמור את אמצעי החיתוך על קרח.
- הכן את אזור החיתוך/חיתוך.
הערה: באופן אידיאלי, הליך זה צריך להיעשות במכסה מנוע סטרילי. אם זה לא אפשרי, ניתן להשאיר את הוויברטומה על שולחן עבודה. במקרה זה, מומלץ להשתמש ברשת לשיער ובמסכת פנים. - בעזרת סכין גילוח חד קצה, גזרו חתיכה מלבנית (כ -2 ס"מ על 0.5 ס"מ) של ג'ל אגרוז והדביקו אותה על במת הוויברטום כך שהצד הארוך פונה ללהב הרטט.
- נקו את כל המשטחים ואת חלקי הוויברטום עם 70% EtOH ונגבו עם מגבוני טישו חיטוי.
הערה: חשוב שכל החלקים שיהיו במגע עם רקמת המוח יהיו יבשים לחלוטין מאחר ש-EtOH יכול לפגוע בתאים. - חבר סכין גילוח סטרילי לוויברטום ובצע בדיקת רטט כדי לראות אם לוויברטום יש פונקציה זו.
- הניחו כלי חיטוי חיטוי, מגבוני טישו חיטוי, ארבע צלחות פטרי קטנות, אזמל עגול, שתי פיפטות זכוכית עם נורות גומי, שתי פיפטות זכוכית פתוחות (ראה סעיף 1.1) ודבק סופר (מרוסס ב-EtOH) במכסה המנוע.
- יוצקים את מדיום החיתוך המבעבע לתוך סירת הוויברטום ולתוך ארבע צלחות הפטרי הקטנות.
הערה: שלב זה צריך להיעשות רק מיד לפני הנתיחה מכיוון שהמדיום מנקודה זו ואילך אינו מבעבע או נשמר על קרח.
- לנתח ולהרכיב מוחות.
הערה: כדי להשיג פרוסות בריאות, שלב זה חייב להיעשות במהירות ובדייקנות. יש צורך בתרגול מסוים. - המתת חסד של בעל חיים #1 על ידי פריקת הצוואר או על פי ההנחיות המקומיות ולאחר מכן עריפת הראש עם המספריים הגדולים.
- בעזרת מספריים קטנים וחדים, הסר במהירות את העור על ידי ביצוע חתך סגיטלי מהצוואר לאף ומשוך אותו הצידה כדי לחשוף את הגולגולת.
- חותכים לאורך התפר הסגיטלי, ואחריו חתכים רוחביים מעל החלק הפנימי של העצמות הקדמיות ותפר הלמבואיד (הגבול בין המוח הקטן למוח הקטן).
- השתמש במלקחיים כדי לכופף את הגולגולת מכל צד. עצבי הגולגולת מנותקים מהמוח על ידי החדרת מרית מעוגלת וחדה מתחת לצד הגחון של המוח והזזת המרית בעדינות לרוחב.
- השתמש בסכין גילוח חד קצה כדי לבצע חיתוך עטרה למוח הקטן.
הערה: חיתוך זה יקבע את הזווית שבה ייחתכו הפרוסות. לכן זה צריך להיעשות בזווית ישרה. - הפוך את המוח מהגולגולת לתוך צלחת פטרי קטנה המכילה מדיום דיסקציה.
- חזור על שלבים 1.6.1. - 1.6.4. עבור חיה #2 והניחו את המוח הזה בצלחת פטרי שנייה.
הערה: החיות אינן סטריליות. בצע את הדיסקציה בצד אחד של מכסה המנוע ולאחר מכן עבור לצד השני, הנקי לאחר שהמוח הוצא מהגולגולת. - החלף כפפות.
- חבר את המוח לשלב הוויברטום: הוסף שכבה דקה של דבק סופר לבמה ממש מול ג'ל האגרוז המותקן. החזק את המוח #1 עם מרית שטוחה גדולה כאשר הצד הטרי (הזנב) נוגע במרית והצד הגחוני פונה (וקרוב ככל האפשר) לג'ל האגרוז.
- לאחר מכן, הנח בעדינות את המוח על הדבק על ידי דחיפתו מהמרית בעזרת סט מלקחיים. הקפידו להשאיר מספיק מקום למוח #2.
הערה: חשוב שהמוח יהיה מחובר היטב לבמה אך ללא דבק מוגזם, מכיוון שהדבר עלול לחסום את החיתוך.
- מיד לאחר העלאת מוח #1, השתמש במרית הגדולה כדי להוסיף כמה טיפות של מדיום דיסקציה על גבי המוח. זה ישמור על לחות המוח, יקשיח את הדבק וימנע ממנו להידבק לצידי המוח.
- חזור על שלבים 1.6.7 ו- 1.6.8. למוח #2.
- חבר את הבמה לסירת הוויברטום.
- חותכים פרוסות עטרה בעובי 230 מיקרומטר עם משרעת של 1 - 1.5 מ"מ, תדר של 85 הרץ ומהירות של 0.2 מ"מ לשנייה. אוספים פרוסות בערך בין 1.4 מ"מ רוסטרל ל -2.1 מ"מ זנב לברגמה.
- אוספים פרוסות לאחר חיתוך כל פרוסה באמצעות פיפטות זכוכית פתוחות (נקודה 1.1). מעבירים את הפרוסות לצלחת פטרי המכילה מדיום חיתוך. השתמש באזמל מעוגל כדי לחתוך את הפרוסות לשני חלקים, ולחלק את שתי ההמיספרות.
- כאשר כל הפרוסות נחתכות, מניחים פרוסות בכלי התרבות.
- הוציאו את צלחת התרבות (אחת בכל פעם) מהחממה.
- בעזרת פיפטות הזכוכית הפתוחות, העבירו בזהירות פרוסה אחת לכל אחד מהקונפטי.
הערה: הפרוסות צריכות להיות מונחות שטוחות באמצע הקונפטי. זה דורש מיומנות מסוימת. עם זאת, אם חלק מהפרוסות אינן מושלמות, עדיף להשאיר אותן מאשר לבזבז זמן בניסיון להזיז אותן, מכיוון שחשוב להכניס את כל הפרוסות לחממה מהר ככל האפשר. - השתמש בפיפטה מזכוכית (קצה מחודד) כדי להסיר בעדינות עודפי מדיום מבלי לגעת בפרוסה.
הערה: אין לטבול פרוסות בנוזל במהלך הדגירה. לפיכך, יש לשאוף את המדיום העודף כך שהפרוסות חשופות לאוויר (סרט דק של מדיום עדיין יכסה את הפרוסות). פרוסות שנשארות שקועות בנוזל בדרך כלל יהיו לא בריאות או ימותו (4 והתצפיות שלנו). - העבירו את המנה בחזרה לחממה ברגע שלכל הקונפטי יש פרוסה אחת.
- חזור על שלבים 1.7.8. - 1.8.4. למנה #2.
- שנו את המדיום התרבותי.
הערה: זה צריך להיעשות יום לאחר החיתוך (יום 1 במבחנה, DIV1) ולאחר מכן כל 2-3 ימים. - מחממים את מדיום התרבות באמבט מים או בחממה.
- במכסה המנוע הסטרילי, השתמש ביניקת ואקום או בפיפטה רגילה עם קצה סטרילי כדי לשאוב מדיום תרבות מכל באר. זה נעשה על ידי הטיה עדינה של המנה (בכ- 30 מעלות) והנחת קצה הפיפטה בקצה תוספת התרבות.
- מוציאים כ-800 מיקרוליטר מכל באר (משאירים מספיק בינוני כדי לשמור על תחתית התוספת מכוסה בבינוניות). לאחר מכן, בעזרת פיפטה נקייה, הוסיפו 800 מיקרוליטר מהמדיום שחומם מראש לכל באר. לאחר מכן, החזירו את הכלים לחממת תרבית התאים.
2. התמרה ויראלית
- לרכוש או ליצור וירוסים הקשורים לאדנו (AAVs) עם פלסמיד מעניין.
הערה: פרוטוקול זה מתאר את השימוש בסרוטיפ AAV 2/8 (AAV 2/8) הנושא dsred או GFP ממוקד מיטוכונדריה כגן מדווח תחת בקרת השעתוק של מקדם החלבון הבסיסי של המיאלין12 (AAV2/8 MBP_mito_dsred או AAV2/8 MBP_mito_GFP) כדי להמחיש מיטוכונדריה אוליגודנדרוציטים. AAV 2/8 הנושא GFP או tdtomato כגן מדווח המונע על ידי מקדם ה-CAG הכללי (AAV 2/8 CAG_GFP או AAV 2/8 CAG_tdtomato) משמש להמחשת ציטופלזמה של אוליגודנדרוציטים. לפיכך, השילוב של AAV2/8 MBP_mito_dsred עם AAV 2/8 CAG_GFP נותן מיטוכונדריה אדומה וציטופלזמה ירוקה באוליגודנדרוציטים, בעוד ששילוב של AAV2/8 MBP_mito_GFP ו-AAV 2/8 CAG_tdtomato נותן מיטוכונדריה ירוקה וציטופלזמה אדומה. המבנים מתוארים ביתר פירוט במקום אחר13. - ביום 7 במבחנה (DIV7), אוליגודנדרוציטים עם ה-AAV מתמרים.
זהירות: פעל לפי תקנות הבטיחות בעת עבודה עם כלי רכב AAV. הקפד לקבל את ההכשרה המתאימה ואת אישור רמת הבטיחות הביולוגית הנדרש. יש לבצע את כל הנקודות הבאות בארון בטיחות ביולוגית Class II באמצעות כפפות וחלוק מעבדה. כאן מתואר יישום של AAV על אזור קליפת המוח של הפרוסות, מכיוון שזה האזור שמראה את ההתאוששות הטובה ביותר. - מדללים את ה- AAV במדיום גידול שחומם מראש (37 מעלות צלזיוס). דילולים סביב 2 × 109 עותקי גנום/מ"ל (GC/mL) מומלצים כדי לקבל התמרה דלילה של אוליגודנדרוציטים המאפשרת הדמיה של תאים בודדים בתוך הפרוסה. עם זאת, יש לבצע פיילוט באמצעות טיטרים שונים כדי להבטיח צפיפות של אוליגודנדרוציטים מותמרים המתאימה לניסויים הספציפיים. אם משתמשים בשני AAV שונים, יש לערבב אותם באותה תמיסה ולהוסיף אותם לפרוסה בו זמנית.
- הוסף כ-1.3 מיקרוליטר AAV מדולל לכל פרוסה. ודא שהחלק החיצוני של קצה הפיפטה יבש. פיפטה 1.3 מיקרוליטר AAV מדולל והחזק את הפיפטה מעל קליפת המוח קרוב ככל האפשר מבלי לגעת בפרוסה עם קצה הפיפטה (במרחק של כ-1 מ"מ).
- ואז דחף לאט את התמיסה החוצה מהפיפטה. כאשר התמיסה נוגעת בפרוסה, הזיזו את קצה הפיפטה מעל קליפת המוח כדי לפזר את התמיסה על כל אזור קליפת המוח.
הערה: יש לבצע הליך זה מהר ככל האפשר כדי להימנע מהשארת הפרוסות מחוץ למכסה המנוע למשך זמן רב מהנדרש. עשו זאת על צלחת אחת בכל פעם והחזירו את המנה הראשונה לחממה לפני שתתחילו במנה #2. כדי לקבל פיזור משביע רצון של AAV מבלי לפגוע ברקמה דורש קצת תרגול ויד יציבה.
- אם מיקרוסקופ פלואורסצנטי זקוף זמין במעבדת התאים, ניתן לבדוק את ביטוי החלבון במהלך הזמן בתרבית על ידי הנחת הצלחת מתחת למיקרוסקופ.
הערה: אין להשאיר את המנה מחוץ לחממה יותר מ-2-5 דקות.
3. הדמיית זמן-lapse
הערה: ניתן לבצע את ההדמיה בכל פעם שרמות הביטוי של הסמנים הפלואורסצנטיים מספיקות, והפרוסות נראות בריאות (בדרך כלל DIV11-14).
- ודא שהמיקרוסקופ, הזילוף והחימום מוגדרים כהלכה כך שתמיסת ההדמיה המבעבעת מחוממת ויכולה להיכנס ולצאת מהאמבטיה.
הערה: קיימים פתרונות שונים לתאי אמבטיה. גרסה פשוטה מוצגת כאן. - צור את הכניסה והיציאות של האמבטיה על ידי מחטי מזרק קהות (כפופות ב-~45 מעלות) המחוברות לדפנות האמבטיה על ידי בלו-טאק/פאן.
- ודא שהצינור עובר מבקבוק של תמיסת הדמיה מבעבעת ברציפות דרך המשאבה הפריסטלטית, דרך צינור החימום של יחידת החימום, ולאחר מכן למחט מזרק הכניסה באמבטיה.
- חבר צינור נוסף לשקע מחט המזרק. לאחר מכן צינור זה עובר דרך המשאבה הפריסטלטית וחוזר לבקבוק תמיסת ההדמיה (או לבקבוק פסולת).
- תמיסת הדמיית בועות עם גז דו חמצני.
הערה: יש להתחיל את זה לפחות 15 דקות לפני ההדמיה ולהמשיך לאורך כל הניסוי. - הפעל משאבה פריסטלטית ותנור חימום והעביר תמיסה דרך האמבטיה כדי להשיג טמפרטורת אמבטיה אופטימלית (37 ± 0.5 מעלות צלזיוס). ודא שחיישן המדחום המחובר ליחידת הטמפרטורה שקוע בתמיסת האמבטיה.
- הפעל את המיקרוסקופ, מנורת הקרינה והלייזרים המתאימים.
- הגדר נתיב אור מתאים לדגימה.
הערה: זה ישתנה בהתאם להגדרת המיקרוסקופ והבדיקה. נדרש ידע כללי כיצד להשתמש במיקרוסקופ הקונפוקלי ולא נעסוק בו כאן. - השתמש במטרת טבילה במים עם ההגדלה והצמצם המספרי המתאימים (n.a.). אנו משתמשים בתוכנית טבילה במים פי 40 (n.a. 1.0).
- פתח חור כדי להשיג חתך אופטי של כ-2 - 2.5 מיקרומטר עבור סרטון ה-Time-lapse. זה מפחית את התרחשות המיטוכונדריה שיוצאת מהמיקוד במהלך דולג זמן.
- העבר פרוסה אורגנוטיפית לאמבטיה:
- הוסף טיפה של תמיסת הדמיה או מדיום תרבית לצלחת פטרי קטנה מפלסטיק.
- במכסה מנוע סטרילי, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר פרוסה אורגנוטיפית אחת מתוספת הממברנה לטיפה. המלקחיים צריכים לגעת רק בקונפטי ולא בפרוסה.
- הניחו את המכסה על צלחת הפטרי.
- החזירו מיד את צלחת התרבות המכילה את שאר הפרוסות לחממה.
- הביאו צלחת פטרי המכילה את הפרוסה למיקרוסקופ.
- כבה את המשאבה הפריסטלטית בזמן העברת הפרוסה לאמבט מיקרוסקופ. ראשית, השתמש במלקחיים כדי להרים קונפטי עם פרוסה מצלחת פטרי לחלק העליון של האמבטיה (הקונפטי יצוף). לאחר מכן הניחו את שני קצות המלקחיים מכל צד של הקונפטי כך שיגעו בקונפטי מבלי לגעת בפרוסה, ודחפו את הקונפטי דרך התמיסה לתחתית האמבטיה. מרכז את הקונפטי באמצע האמבטיה.
- השתמש במלקחיים כדי להניח את עוגן האחיזה (נבל) על גבי הקונפטי מבלי לגעת בפרוסה.
הערה: נבל הוא עוגן פלטינה בצורת פרסה המשמש למניעת הפרוסה לצוף או להיסחף באמבטיה. עבור פרוסות חדות, מיתרים דקים עוברים מצד אחד של הנבל לצד השני (בדומה לנבל מוזיקה). עבור פרוסות אורגנוטיפיות, הנבל צריך להיות ללא חוטים ולהתאים לגודל הקונפטי בצורה כזו שהוא יכול להניח על גבי הקונפטי מבלי לגעת בפרוסה. - הפעל שוב את המשאבה הפריסטלטית.
- הורד את המטרה למטה למדגם.
- בחר תא ואזור לתמונה.
הערה: הימנע מחשיפה מוגזמת של התאים לאור לייזר מכיוון שהדבר עלול לגרום לרעילות התאים (ראה טיפים בנקודות למטה). - השתמשו בעיניות ובמנורת הפלורסנט כדי למצוא אוליגודנדרוציטים בעלי מראה בריא עם המראה הנכון. בדרך כלל, אוליגודנדרוציטים שיש להם ביטוי יתר חזק של חלבון פלואורסצנטי נראים לא בריאים. לאוליגודנדרוציטים לא בריאים יהיו תהליכים בעלי מראה בלובי, והמיטוכונדריה תיראה מקוטעת. באוליגודנדרוציטים בריאים, הסומה והתהליכים נראים חלקים, ולמיטוכונדריה יש אורכים שונים (אם כי הם בדרך כלל קצרים בהרבה מאשר בתאי עצב ואסטרוציטים).
- מקם את התא המעניין באמצע שדה הראייה.
- השתמש בפונקציה "חיה" בתוכנה (עבור מיקרוסקופים של Leica ו-Zeiss) כדי לזהות את התא על המסך ולבחור תחום עניין, למשל, חלק בתא המכיל מספר תהליכים ראשוניים או מעטפת מיאלין או תהליך בודד או מעטפת מיאלין.
הערה: כדי להיות מסוגל לדמות כמה שיותר מהתהליכים/מעטפות, בחר אזורים המכילים תהליכים המונחים שטוחים יחסית בכיוון xy. - התקרב לתחום העניין (בדרך כלל הפקת תמונה בגודל פיקסלים של 0.14 - 0.30 מיקרומטר).
- בעזרת הכלי "אזורים", ציירו מלבן סביב האזור ובחרו באפשרות לסרוק רק את האזור שנבחר. זמן הסריקה, ובכך החשיפה ללייזר, מצטמצם על ידי סריקת האזור הנבחר בלבד.
הערה: אזורים מלבניים אופקיים ייסרקו מהר יותר מאזורים אנכיים בשל המספר הקצר יותר של קווים סרוקים הדרושים. אם אזור מלבן אנכי נסרק, ניתן להפחית את זמן הסריקה על ידי סיבוב שדה הסריקה ב-90 מעלות (באמצעות כלי הסיבוב).
- התאם את עוצמת הלייזר והרווח כדי לקבל תצוגה טובה של המיטוכונדריה.
הערה: השתמש בעוצמת הלייזר המינימלית הדרושה. במידת האפשר, הגבר את הרווח במקום להגדיל את עוצמת הלייזר. בנוסף לגרימת רעילות תאים, עוצמת לייזר גבוהה מדי תלבין את האובייקטים המצולמים לאורך זמן, ובכך תדרוש עלייה נוספת של עוצמת הלייזר או רווח במהלך הסריקה. עוצמת הלייזר והרווח הנדרשים יהיו תלויים ברמת הביטוי ובמיקרוסקופ. עם מיקרוסקופ קונפוקלי LSM700, אנו משתמשים בלייזר 555 ננומטר בהספק של 20-40 μW כדי לצלם dsred או tdtomato, ולייזר 488 ננומטר משמש ב-20 - 30 μW להדמיית GFP (עוצמת לייזר נמדדת בצמצם האחורי של המטרה). הרווח מוגדר גבוה עבור הדמיה חיה, בדרך כלל בטווח של 700 - 800 עבור GFP ו- 850-980 עבור dsred ו- tdtomato. הרווח הגבוה עלול לגרום לרעשי רקע נוספים, אשר מוסרים על ידי הגדלת ההיסט הדיגיטלי (ערכי היסט בדרך כלל נעים בין 0 ל-15). מניסיוננו, שימוש MBP_mito_GFP נותן אות לרעש טוב יותר מאשר MBP_mito_dsred. - בחר מהירות סריקה.
הערה: צמצם את זמן הסריקה על-ידי שימוש במהירות סריקה גבוהה ועל-ידי ציור אזור סריקה קטן (ראה סעיף 4.10.5 להלן). אפשר גם לחסוך זמן סריקה על ידי ביצוע סריקה דו-כיוונית. עם זאת, זה לא מומלץ בגלל איכות תמונה ירודה יותר. - הגדר את התדירות ומשך הזמן של הקלטת זמן-lapse, למשל, צלם תמונות כל 2 שניות למשך 20 דקות בסך הכל להדמיה מיטוכונדריאלית באוליגודנדרוציטים.
הערה: יש להגדיר את התדירות ומשך הזמן בהתאם לניידות של האובייקטים המעניינים. תדר גבוה יותר יחשוף את הדגימה ליותר אור לייזר, אך עצמים הנעים מהר יותר דורשים גם משך זמן כולל קצר יותר של סרטוני זמן-lapse (למשל מיטוכונדריה בנוירונים, שנעים בתדירות גבוהה יותר ובמהירות גבוהה בהרבה מהמיטוכונדריה באוליגודנדרוציטים, מצולמים בדרך כלל כל שנייה במשך 2 דקות בסך הכל16). - התחל הקלטת קיטועי זמן.
הערה: המיטוכונדריה עלולה לצאת מהמיקוד ו/או להיסחף מחוץ לאזור המצולם במהלך ההקלטה. כדי למזער רעידות ותנועה, כוונן את הכניסה והיציאות של האמבטיה והפחית את מהירות המשאבה במידת הצורך. בדרך כלל עדיין מתרחשים שינויים קטנים במיקוד. לפיכך, נדרש ניטור רציף של המסך במהלך ההדמיה, עם התאמות קטנות של המיקוד במהלך ההקלטה.
לכוד ערימת z של התא כולו לזיהוי עתידי של התא ותהליך ההדמיה.
הערה: לרזולוציה טובה יותר, יש לאפס את חור הסיכה ליחידה אוורירית אחת עבור מחסנית ה-z.