מיקרוסקופיה דו-פוטונית לחקר משיכה של תהליך מיקרוגליה לתרכובת בפרוסת מוח של עכבר

<

1. מיקרוסקופיה דו-פוטונית

1. הגדרת פרמטרים
   1. הפעל את מערכת הרב-פוטונים (גלאים היברידיים, לייזר, סורק, מודולטור אלקטרו-אופטי, מיקרוסקופ).
   2. כוון את הלייזר ב-920 ננומטר, בדוק שהלייזר נעול מצב, והגדר את ההספק ל-5% - 15% ואת הרווח ל-10%. זה מתאים להספק של 3 - 5 מגוואט מתחת למטרה. ודא שהגלאים הלא סרוקים מופעלים וכי מותקנים מסנני פליטה ועירור מתאימים.
   3. הגדר את הפרמטרים של תוכנת ההדמיה לערכים הבאים: עבור גודל המסגרת, 1024 x 1024 פיקסלים המתאימים לשטח של 295.07 x 295.07 מיקרומטר; לזום, 2. אם האות רועש מאוד, החל ממוצע קו של 2. עבור דינמיקת הפיקסלים, הגדר את תוכנת ההדמיה ל- 12 סיביות או יותר.
      NOTE: תמונות עם ערך סיביות גבוה יותר מאפשרות לחוקרים להבחין בהבדלים קטנים יותר בעוצמת הקרינה מאשר תמונות עם ערך סיביות נמוך יותר: שינוי של ערך אפור אחד בתמונה של 8 סיביות יתאים לשינוי של 16 ערכי אפור בתמונה של 12 סיביות ושל 256 ערכי אפור בתמונה של 16 סיביות. לכן, תמונות סיביות גבוהות יותר מתאימות יותר לניתוח כמותי, אך ככל שגודלן גדל עם עומק הסיביות, קיבולת האחסון וכוח המחשוב יכולים להיות מגבילים.
   4. בחר את מצב הסריקה XYZT עם טווח מרווח Z ב-2 מיקרומטר ומרווח T של 2 דקות.
      NOTE: הרזולוציה x,y ו-z נקבעת על ידי משפט הדגימה של נייקוויסט. גודל צעד Z של כ-0.8 יהיה אופטימלי לפתרון תהליכי מיקרוגליה (בקוטר של <1 מיקרומטר), אך הרזולוציה האופטית של מיקרוסקופ מולטיפוטון מגבילה (ב-920 ננומטר עם מטרה של 0.95 NA, הרזולוציה הצירית היא בסביבות 1 מיקרומטר). בנוסף למחסום הפיזי הזה, בניסוי הדמיה חיה, הרגישות או יחס האות לרעש, הרזולוציה, המהירות וזמן התצפית הכולל חשובים. אם ניקח בחשבון את כל הפרמטרים הללו, נבחרו כאן צעד z של 2 מיקרומטר, גודל תמונה של 1024 x 1024 פיקסלים ורכישה במהירות גבוהה באמצעות סורק תהודה בשילוב עם גלאי HyD (לוקח בערך 15 שניות לרכוש 50 תוכניות z). תדירות הרכישות היא סדרת XYZT אחת כל 2 דקות, ומשך הזמן הכולל הוא 30 דקות. אם ההגדרה אינה מהירה או רגישה מספיק, ניתן להפחית את הרזולוציה הרוחבית (עד 512 x 512) או את מספר פרוסות ה-z (על ידי הדמיה אך ורק בעומק z המציג את הקרינה החזקה ביותר [כלומר, לא פרוסות z העמוקות ביותר שבהן הקרינה חלשה]), או כדי להפחית את מהירות הסורק. ניתן להקטין את הרזולוציה הצירית גם על ידי הגדלת צעד z עד 3 מיקרומטר, אך מכיוון שהדבר עשוי להשפיע על הכמות, יש לבצע את כל הניסויים להשוואה עם אותו צעד z.
      NOTE: ניתן לבצע ניסויים דומים על פרוסות מעכברי CX3CR1creER-YFP, קו עכבר המשמש לגרימת מחיקה גנטית במיקרוגליה בלבד ובו מיקרוגליה מבטאת באופן מכונן חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP). עם זאת, רמת הביטוי של YFP נמוכה מאוד בהשוואה לחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) ב-CX3CR1^GFP/+ עכברים; לפיכך, הדמיה אפשרית אך מאתגרת ודורשת אופטימיזציה של פרמטרי הרכישה. מומלץ להתאים אותם באופן הבא.
   5. כוון את הלייזר ב 970 ננומטר (המותאם טוב יותר לעירור YFP מאשר 920 ננומטר), ההספק ב -50%, והרווח ב -50%, המתאים לעוצמת לייזר תחת המטרה של 5 - 6 mW.
   6. הגדר ממוצע קו של 4 (או יותר) כדי לשפר את יחס האות לרעש.
2. מיקום הפרוסה ושל המיקרופיפטה מזכוכית, והיישום המקומי של התרכובת
   1. חבר את המשאבה הפריסטלטית לתא ההקלטה, 30 דקות לפני תחילת ההקלטה. לאחר ניקוי כל מערכת הזילוף עם 50 מ"ל מים טהורים במיוחד, התחל את הזלוף של תא ההקלטה עם aCSF (50 מ"ל) הכלול בכוס זכוכית תחת קרבוגנציה מתמדת. לאורך כל הניסוי, שמור על ה-aCSF במחזור ל-32 מעלות צלזיוס עם מחמם מוטבע או מחמם פלטייר.
      NOTE: תא זלוף ספציפי עם זלוף עליון ותחתון נועד לייעל את החמצון משני צידי הפרוסה. תא הזלוף מורכב משני חלקים המתאימים להפליא, עם רשת פוליאמיד מתוחה ביניהם (איור 1A,B). בהשוואה לסוגים אחרים של תאים, שבהם הפרוסה מונחת ישירות על כיסוי זכוכית, תא זה מפחית את המוות העצבי בחלק התחתון של הפרוסה, משפר את הכדאיות ומפחית את תנועות הפרוסה הנגרמות על ידי הנפיחות שלה.
   2. בעזרת פיפטת העברה חד פעמית עם פה רחב, העבירו את פרוסת המוח להדמיה לכוס ה-aCSF כדי להסיר את נייר העדשה, הניחו לה לשקוע (כהוכחה לכך שלא מחוברת בועת אוויר), והעבירו אותה לתא ההקלטה (זילוף).
   3. מקם מחזיק פרוסה (סיכת ראש עשויה פלטינה עם שני הענפים המחוברים בחוטי ניילון מקבילים) על הפרוסה כדי למזער את תנועת הפרוסה עקב זרימת הזלוף.
   4. השתמש בתאורת השדה הבהיר כדי למקד את אזור העניין במוח (זמן חשיפה: 50 עד 80 אלפיות השנייה) באמצעות אובייקט הגדלה נמוך (5X או 10X). עבור למטרת הטבילה במים בהגדלה גבוהה יותר (25x עם עדשת 0.35x) והתאם את המיקום.
      NOTE: הימנע מתמונות של שדות קרובים לחוטי הניילון של מחזיק הפרוסה, מכיוון שהם עלולים לחסום את האור ולעוות את הפרוסה באופן מקומי. ודא שאזור העניין שטוח. במידת הצורך, הסר את מחזיק הפרוסה כדי למקם מחדש את הפרוסה ו/או את מחזיק הפרוסה.
   5. השתמש בתאורת הקרינה כדי לאתר תאי מיקרוגליה פלואורסצנטיים להדמיה בשדה (זמן חשיפה: 250 - 500 אלפיות השנייה).
      NOTE: שלב זה מאפשר לחוקרים לבדוק את נוכחותם של תאים באזור העניין ואת עוצמת הקרינה שלהם, ולשלוט בכמות הפסולת התאית.
   6. מלא מחדש את הפיפטה ב-10 מיקרוליטר של aCSF עם ATP, 5-HT או התרופה המעניינת בריכוז הסופי שלה. כוון את הקצה כלפי מטה ונער בעדינות את הפיפטה המלאה בתרופות כדי להסיר בועות אוויר כלואות בקצה.
      NOTE: אם התמיסה שיש להזריק נוטה ליצור בועות, שקול להשתמש בפיפטות בורוסיליקט עם נימה פנימית. דליפה של ATP מהפיפטה יכולה למשוך תהליכי מיקרוגליה עוד לפני ההזרקה (אם זה קורה, זה יהיה גלוי בשלב הניתוח). למרות שזה אמור להיות מתון עם ריכוז ה-ATP בשימוש (500 μmol·L^-1), אם זו בעיה, שקול למלא מראש את המיקרופיפטה ב-2 מ"ל של aCSF לפני הוספת תמיסת ה-ATP (או תרכובת אחרת) בשלב 1.2.6.
   7. הרכיבו את הפיפטה המלאה במחזיק פיפטה, המחובר בצינור שקוף למזרק של 5 מ"ל, עם בוכנה הממוקמת במצב 5 מ"ל. מחזיק הפיפטה עצמו מותקן על מיקרומניפולטור תלת-צירי.
   8. תחת תאורת שדה בהיר, השתמש במיקרומניפולטור כדי למקם את הפיפטה במרכז השדה. לקבלת מרכוז אופטימלי וניתן לשחזור, הצג והשתמש בסרגלים בתמונה.
   9. הורד את הפיפטה בעדינות לכיוון הפרוסה, שלוט והתאם את המטרה בו זמנית עד שקצה הפיפטה נוגע קלות במשטח הפרוסה. עצירת ירידת הפיפטה ברגע שנראה שנגעו בפרוסה מאפשרת לקצה הפיפטה לחדור 80 - 100 מיקרומטר מפני השטח של הפרוסה (ראה איור 2B).
   10. כוונו את הלייזר (ראו את הפרמטרים למעלה) והעבירו את המיקרוסקופ למצב מולטיפוטון. ודא שהתא מוקרן מכל מקור אור (למשל, מסך מחשב). הפעל את הגלאים הלא סרוקים והגדר את הרווח. השתמש בטבלת חיפוש (LUT) עם גבול עליון מקודד צבע כדי למנוע רוויה של הפיקסלים בתמונה.
   11. קבע את עובי הפרוסה שיש לצלם (כלומר, מיקומי ה-z העליונים והתחתונים שבהם ניתן לזהות פלואורסצנטיות [בדרך כלל בין 220 ל-290 מיקרומטר בסך הכל]).
       NOTE: על פני השטח של הפרוסה יש צפיפות מוגברת של תהליכים ואולי של מיקרוגליה, לעתים קרובות עם מורפולוגיה יוצאת דופן, בהשוואה לחלק הפנימי של הפרוסה. הצטברות זו תהיה בולטת יותר עם הזמן (כלומר., גלוי יותר באחרון מאשר בפרוסת המוח הראשונה שצולמה). לכן, אין להשתמש במישורי ה-z ב~30 מיקרומטר הראשונים לניתוח ואף ניתן לדלג עליהם לצורך הרכישה.
   12. התחל להקליט למשך זמן כולל של 30 דקות (או יותר אם תרצה) ולאחר קו בסיס של 5 דקות, החל באופן מקומי את התרכובת לבדיקה (מבלי להפריע להדמיה). לשם כך, לחץ לאט על הבוכנה של המזרק המחובר למיקרופיפטה, מ -5 מ"ל למצב 1 מ"ל (תוך כ -5 שניות). יש להרגיש מיד התנגדות בעת לחיצה על הבוכנה. אם לא, הקצה עלול להישבר.
       NOTE: עבור נסיין מיומן, ההזרקות בשיטה זו ניתנות לשחזור, אך לחלופין למניפולציה ידנית של מזרק, ניתן לקשר את הפיפטה למערכת פליטת לחץ אוטומטית כדי לאפשר שליטה טובה יותר בנפח המועבר. ההזרקה יוצרת עיוות פיזי של הפרוסה במקום ההזרקה. עיוות זה נראה מאוחר יותר בשתיים או שלוש התמונות הראשונות לאחר ההזרקה, אך לא אמור להיות גלוי בתמונה הרביעית (כלומר, 8 דקות לאחר ההזרקה). אם זה נמשך, שקול לשנות את הפרמטרים להכנת הפיפטה.
   13. בתום הרכישה (30 דקות), השליכו את המיקרופיפטה והוציאו את הפרוסה.
   14. לפני שתתחיל לדמות פרוסה חדשה, צור את הסרט הדו-ממדי (סעיף 2.1) על מנת לבדוק שלמיקרוגליה יש מורפולוגיה נורמלית והם זזים, ולכן הפרוסות בריאות.

2. ניתוח המשיכה של תהליכי מיקרוגליאל

1. תיקון הקרנה וסחיפה דו-ממדית<ol style='margin-bottom:0;margin-top:0;padding-inline-start:48px;'>
2. פתח את הקובץ (. LIF) עם פיג'י.
3. במידת הצורך, צור תת-מחסנית (image/stacks/tools/make substack) רק עם מישורי ה-z המעניינים. לדוגמה, אל תכלול את מישורי ה-z המתאימים לפני השטח של הפרוסה אם הם נרכשו אך אין להשתמש בהם לניתוח (ראה הערה לאחר שלב 1.2.11) ואת מישורי ה-z העמוקים ביותר ללא פלואורסצנטיות. הערימה הסופית מכילה בדרך כלל 90 - 110 פרוסות z (180 - 220 מיקרומטר).
4. הפעל את Z project function (תמונה/ערימות/Z פרויקט") ובחר בלחצן עוצמה מקסימלית סוג הקרנה כדי ליצור את ההקרנות של מחסנית ה-z שנרכשו בכל פעם נקודה.
5. הפעל את MultiStackReg plugin (תוסף/רישום/MultiStackReg), בחירה פעולה 1: יישור ו-טרנספורמציה: גוף קשיח לתקן סחיפות קלות שעלולות להתרחש במהלך הרכישה. שמור סרט דו-ממדי זה כקובץ חדש (.tiff).

איור 1: פרטי תא ממשק. (A) מתאר להדפסה תלת-ממדית של מחזיק הפרוסה. הקוטר החיצוני של המחזיק הוא 7 ס"מ. (B) מחזיק פרוסות ממשק עם רשת הניילון (חץ) המאפשר לחוקרים לשמור פרוסות בממשק נוזל-אוויר. (C) מכשיר תא ממשק המאפשר לשמור על הפרוסות בסביבה קרבוגן (החץ מציין את הצינור לבעבוע) ולחה לפני הצילום.

איור 2: פרטי תא הזילוף. (A) מתווה להדפסת תלת מימד. הקוטר החיצוני של תא הזלוף הוא 5.9 ס"מ. (B) תא הזלוף עם רשת הניילון (חץ) התומך בפרוסה, מונע ממנה לגעת במגלשה שמתחתיה ומאפשר ל-aCSF לזרום מעליו ומתחתיו. (C) תמונה של המכלול במיקרוסקופ עם שני פוטונים. המיקרופיפטה שתספק את התרכובת באופן מקומי נראית מימין (כוכבית). (D) פיפטה מצולמת בשדה בהיר. סרגל קנה המידה = 60 מיקרומטר.

איור 3: מיקום המיקרופיפטה בפרוסה. דוגמה לרכישה של ערימת תמונות (בהיפוקמפוס של חיה בת 30 יום) עם מיקרופיפטה מלאה בפלואורסצאין (1 מיקרומטר). פלואורסצאין מאפשר לאתר את הפיפטה (כוכבית) בהקרנות המקסימליות לאורך (A) ציר ה-z או (B) ציר ה-y. שימו לב בלוח B שלמרות שהם חיוורים יותר בפלואורסצנטיות, יש גם מיקרוגליה מתחת לקצה הפיפטה. בדוגמה המאויירת הזו, הערימה המלאה, כולל התמונות שצולמו בחלק השטחי ביותר של הפרוסה, שימשה להקרנות. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר בחלונית A וכפי שמצוין (כל סיום = 50 מיקרומטר) בחלונית B. עובי ה-z של הערימה = 220 מיקרומטר.

איור 4: דוגמאות לניסויים תת-אופטימליים. פרוסות אלה חיכו יותר מ-6 שעות לפני ההדמיה וצולמו מאז פני השטח העליונים שלהן. (A) דוגמה לערימת z עם הרבה פסולת (חלקיקים פלואורסצנטיים עגולים בערך, אך עם גבולות לא סדירים; כוכביות) ומיקרוגליה "עבותה" (חצים), כלומר עם תהליכים רבים אך קצרים. שימו לב למסופי התהליך המוגדלים (ראשי חץ) שנראים כמו חרוטי צמיחה אקסונליים. עובי ה- z של הערימה = 220 מיקרומטר. שני הפאנלים האחרים מציגים שתי תת-ערימות של אותה פרוסה, עם (B) 1-30 מישורי z (עובי z = 59 מיקרומטר) ו-(C) 30-120 מישורי z (עובי z = 180 מיקרומטר). במישורים העליונים (מוצגים בחלונית B), בנוסף למסופי התהליך הגדולים והפסולת כמו בלוח A, יש מיקרוגליה עם גופים שטוחים גדולים או בליטות (כוכבים) יוצאי דופן. במישורים העמוקים יותר (מוצגים בחלונית C), אין פסולת או עצמים שטוחים, אבל התאים עבותים (חצים) והצפיפות גבוהה בצורה יוצאת דופן. בסך הכל, תצפיות אלה מצביעות על כך שהמיקרוגליה אינה במצב נורמלי.