הדמיה מיקרוסקופית של תאי עצב בקטע מוח של עכבר באמצעות צביעה מתכתית של גולגי-קוקס

תקציר

מקור: Louth, E. L., et al. הדמיית נוירונים בתוך מקטעי מוח עבים בשיטת גולגי-קוקס. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים הדמיית נוירונים בקטע מוח עבה מוכתם גולגי-קוקס על ידי הגדרת גבולות מיקוד עליונים ותחתונים ולכידת תמונות חופפות. מיקומים מרובים מצולמים כדי להבטיח הקרנות עצביות מפורטות, המשולבות ליצירת ייצוג תלת מימדי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. Golgi-Cox Staining

1. Golgi-Cox Impregnation of Brains
   1. הכינו את תמיסת גולגי-קוקס של 1% (w/v) אשלגן דיכרומט, 0.8% (w/v) אשלגן כרומט, ו-1% (w/v) כלוריד כספי על ידי המסת האשלגן דיכרומט ואשלגן כרומט בנפרד במים איכותיים. מערבבים את התמיסות, מוסיפים את הכלוריד הכספי ומסננים את התמיסה הסופית באמצעות נייר סינון דרגה 1. אחסן את התמיסה בחושך עד חודש.
   2. הרדמו את העכבר באמצעות איזופלורן 5%.
   3. המתת חסד של העכבר על ידי עריפת ראש והסר במהירות את המוח.
   4. הנח את המוח לתוך בקבוקון זכוכית של 20 מ"ל המכיל תמיסת גולגי-קוקס של 17 מ"ל ודגר בחושך ב-RT למשך 25 יום.
   5. הגן על המוח בהקפאה על ידי הכנסתו לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של סוכרוז (30% (w/v) סוכרוז במאגר פוספט של 0.1 M, pH 7.4) בחושך ב-4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
      הערה: ניתן להשתמש בשלושת השלבים האופציונליים הבאים כחלופה לפרוטוקול הראשי, על מנת להקפיא את המוח בשלב זה לאחסון לטווח ארוך.
   6. הקפיאו את כל המוח על ידי טבילתו באיזופנטן של 200 מ"ל מקורר מראש על קרח יבש.
   7. הנח את המוח הקפוא בצינור חרוטי של 50 מ"ל ואחסן אותו בחושך בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
   8. כאשר אתה מוכן להמשיך, הפשירו את המוח על ידי הכנסתו לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 40 מ"ל של חומר קריאופרוטקט סוכרוז והשארתו בחושך בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
2. Brain Sectioning
   1. הסר את המוח מהסוכרוז וחסום אותו לחתך על ידי כריתת המוח הקטן באמצעות סכין גילוח והשארת קצה שטוח בקצה הזנב הנותר של המוח.
   2. מחממים אגר (3% (w/v) במים) עד שהוא נמס, ואז נותנים לו להתקרר עד שהוא מעט מעל נקודת ההיתוך שלו.
   3. הניחו את המוח בכלי שקילה חד פעמי קטן כשהקצה הזנבי שלו פונה כלפי מטה, והוסיפו כמות מספקת של אגר מומס כדי לכסות אותו.
   4. לאחר שהאגר התמצק, חתוך את עודפי האגר, והשאיר כ-2 - 4 מ"מ סביב המוח, והדביק את המוח לשלב הוויברטום כשקצהו הזנבי פונה כלפי מטה באמצעות כמות קטנה של דבק אתיל ציאנואקרילט.
   5. מלאו את אזור הבמה של הוויברטום בכמות מספקת של סוכרוז קריופרוטקטנט כדי לכסות את המוח, וחתכו את המוח בעובי פרוסה של 400 - 500 מיקרומטר (תלוי באזור המוח שיש לבדוק) באמצעות תדר רטט של 86 הרץ ומהירות התקדמות להב של 0.125 מ"מ לשנייה.
   6. בעזרת מברשת צבע קטנה, הנח חלקי מוח לבאר של צלחת תרבית רקמה בת 6 בארות המכילה תוספות תחתית רשת זמינות מסחרית וממולאות מראש ב-10 מ"ל של 6% (w/v) סוכרוז במאגר פוספט של 0.1 M, pH 7.4.
   7. דגירה של קטעים בחושך ב-4 מעלות צלזיוס O/N.
3. Developing Brain Sections
   1. העבירו קטעי מוח לבאר חדשה המכילה 5 מ"ל של 2% (w/v) paraformaldehyde (PBD) במאגר פוספט של 0.1 M, pH 7.4, באמצעות תוספות תחתית הרשת. דגירה על נדנדה, תנועה איטית בחושך ב-RT למשך 15 דקות.
   2. יש לשטוף את החלקים פעמיים על ידי העברתם לבארות חדשות המכילות 5 מ"ל מים. יש לשטוף אותם על נדנדה הנעה במהירות מתונה בחושך ב- RT למשך 5 דקות.
   3. העבירו חלקים לבאר חדשה המכילה 5 מ"ל של 2.7% (v/v) אמוניום הידרוקסיד. דגירה על נדנדה, תנועה איטית בחושך ב-RT למשך 15 דקות.
   4. יש לשטוף את החלקים פעמיים על ידי העברתם לבארות חדשות המכילות 5 מ"ל מים. יש לשטוף אותם על נדנדה הנעה במהירות מתונה בחושך ב- RT למשך 5 דקות.
   5. העבירו חלקים לבאר חדשה המכילה 5 מ"ל של Fixative A מדולל במים פי 10 מהריכוז המקורי שנרכש. דגירה על נדנדה, תנועה איטית בחושך ב-RT למשך 25 דקות.
   6. יש לשטוף את החלקים פעמיים על ידי העברתם לבארות חדשות המכילות 5 מ"ל מים. יש לשטוף אותם על נדנדה הנעה במהירות מתונה בחושך ב- RT למשך 5 דקות.
4. הרכבה של קטעי מוח
   1. בעזרת מכחול קטן, הרכיב קטעים על שקופיות מיקרוסקופ. בעזרת פינצטה ורקמה קטנה מסירים עודפי מים ואגר. ודא שכל האגר מוסר לפני שתמשיך בהתייבשות.
   2. אפשר לקטעים להתייבש באוויר ב-RT למשך כ-45 דקות (מקטעים של 400 מיקרומטר) או 90 דקות (מקטעים של 500 מיקרומטר).
      הערה: התזמון ורמת היובש הנכונה הם קריטיים וייתכן שיהיה צורך לקבוע אותם בכל מעבדה בהתאם לטמפרטורת הסביבה ולחות. זמן ייבוש קצר מדי מוביל לנפילת חלקים ממגלשות במהלך שלבי ההתייבשות הבאים, וזמן ייבוש ארוך מדי מוביל לפיצוח קטעים. חלקים עדיין ייראו מבריקים ברמת היובש המתאימה.
   3. מכתים קטעים בסגול קרסיל על ידי הנחת שקופיות בצנצנות צביעה של קופלין כפי שמצוין.
      הערה: ניתן להשתמש בצעד אופציונלי זה עבור קטעים שמעולם לא הוקפאו כדי להכתים גרעיני עצב בסגול קרזיל. מצאנו כי ניקוי והתייבשות מחדש של קטעים לפני הדגירה בסגול קרזיל מוביל לכתמים אחידים ורקע נמוך על פני קטעים.
      1. הנח בסוכן הסליקה למשך 5 דקות. חזור על הפעולה פעם אחת.
      2. מניחים ב-100% אתנול למשך 5 דקות. חוזרים על הפעולה פעם אחת.
      3. הניחו 95% אתנול במים, לאחר מכן 75% אתנול במים, ולאחר מכן 50% אתנול במים למשך 2 דקות כל אחד.
      4. מניחים במים למשך 5 דקות.
      5. מניחים ב-0.5% (w/v) סגול קרסיל במים למשך 7 דקות.
      6. מניחים במים למשך 2 דקות. חוזרים על הפעולה פעם אחת.
   4. ייבש חלקים על ידי הנחת שקופיות בצנצנות צביעה של קופלין כפי שמצוין.
      1. הניחו 50% אתנול במים, לאחר מכן 75% אתנול במים, ולאחר מכן 95% אתנול במים למשך 2 דקות כל אחד.
      2. מניחים ב-100% אתנול למשך 5 דקות. חוזרים על הפעולה פעם אחת.
      3. הנח בחומר הסליקה למשך 5 דקות. חזור על הפעולה פעם אחת.
         הערה: זמני ההתייבשות והניקוי האלה מספיקים כדי לעבד מוחות של עכברים כמתואר בכתב היד הזה. עם זאת, ראינו שעבור מינים אחרים, כולל חולדות וציפורי בוקר, ייתכן שיהיה צורך להאריך את שלב הפינוי הסופי עד 15 דקות בסך הכל.
   5. קטעי כיסוי באמצעות מדיום הרכבה נטול מים.
   6. אפשר לשקופיות להתייבש אופקית בחושך ב-RT למשך 5 ימים לפחות.

2. הדמיית נוירונים מוכתמים בתוך קטעי

1. מוח עביםלכידת ערימות תמונות
   1. הפעל את נורת המיקרוסקופ, המצלמה ובקר הבמה.
   2. פתח את תוכנת המיקרוסקופ (למשל, Neurolucida).
   3. הנח שקופית על במת המיקרוסקופ.
   4. צלם תמונה דו-ממדית רחבה של מקטע המוח באמצעות אובייקט הגדלה נמוכה כגון 1.25X 0.4 N.A. PlanAPO או 4X 0.16 N.A.
      1. התמקד בתמונה והתאם את הגדרות המצלמה, כולל זמן החשיפה ואיזון הלבן.
      2. צור נקודת התייחסות על ידי לחיצה שמאלית במקום כלשהו במקטע
      3. צלם את התמונה על ידי בחירה באפשרות "רכוש תמונה בודדת" בחלון רכישת התמונה.
   5. צלם ערימות תמונות ברזולוציה בינונית של האזור המכיל את הנוירונים המעניינים באמצעות אובייקט 10X 0.3 NA UPlan FL N.
      1. התמקד בתמונה והתאם את הגדרות המצלמה, כולל החשיפה ואיזון הלבן.
      2. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת התמונות על ידי התמקדות בחלק העליון של המקטע ובחירה באפשרות "set" ליד "top of stack" בחלון רכישת התמונות, ולאחר מכן התמקדות בתחתית המקטע ובחירה ב-"set" ליד "bottom of stack" בחלון רכישת התמונות.
      3. הגדר את מרחק הצעד ל-5 מיקרומטר על ידי הזנת "5 מיקרומטר" ליד "מרחק בין תמונות" בחלון רכישת התמונה.
      4. לכוד את אוסף התמונות על-ידי בחירה באפשרות 'רכש אוסף תמונות' בחלון רכישת התמונה.
      5. חזור על השלבים שלעיל כדי ללכוד את כל אזור העניין, וודא שכל אוספי התמונות חופפים ב- 10% לפחות בצירי X ו- Y.
   6. צלם ערימות תמונות ברזולוציה גבוהה של האזור המכיל את הנוירון המעניין באמצעות מטרת טבילה בשמן סיליקון 30X 1.05 NA.
      1. מרחו 3-4 טיפות שמן טבילה מסיליקון על השקופית והניחו את המטרה מעל השקופית, תוך הבטחת מגע בין המטרה לשמן.
      2. התמקד בתמונה והתאם את הגדרות המצלמה, כולל החשיפה ואיזון הלבן.
      3. הגדר את הגבולות העליונים והתחתונים של ערימת התמונות על ידי התמקדות בחלק העליון של המקטע ובחירה באפשרות "set" ליד "top of stack" בחלון רכישת התמונות, ולאחר מכן התמקדות בתחתית המקטע ובחירה ב-"set" ליד "bottom of stack" בחלון רכישת התמונות.
      4. הגדר את מרחק הצעד ל-1 מיקרומטר על ידי הזנת "1 מיקרומטר" ליד "מרחק בין תמונות" בחלון רכישת התמונה.
      5. לכוד את אוסף התמונות על-ידי בחירה באפשרות 'רכש אוסף תמונות' בחלון רכישת התמונה.
      6. חזור על השלבים שלעיל כדי ללכוד את כל אזור העניין, וודא שכל אוספי התמונות חופפים ב- 10% לפחות בצירי X ו- Y.
   7. שמור את קובץ הנתונים ואת כל קבצי התמונה בתבנית TIFF לעיבוד חיצוני.
2. יצירת תמונות הקרנת Z ומונטאז'ים של תמונות
   1. Create Z-projection images in ImageJ
      1. Open ImageJ software שמותקן בה התוסף Bio-Formats.
      2. בחר "תוספים" -> "bio-formats" -> "bio-formats importer".
      3. בחר את קובץ אוסף התמונות לפתיחה.
      4. לאחר פתיחת הקובץ, שנה את הפורמט ל-RGB על ידי בחירה ב-"תמונה" -> "סוג" ->"צבע RGB".
      5. צור את הקרנת Z על ידי בחירה ב-"Image" ->-"Stacks" ->-"Z Project...".
      6. שמור את תמונת הקרנת Z הדו-ממדית כקובץ TIFF.
   2. צור מונטאז' תמונה דו-ממדי של כל אזור העניין.
      1. פתח את התוכנה (למשל, Adobe Photoshop).
      2. בחר "קובץ" -> "אוטומציה" -> "מיזוג תמונות".
      3. בחר "עיון" ולאחר מכן הוסף את כל קבצי התמונה למיזוג.
      4. ודא ש"מיזוג תמונות" נבחר ולאחר מכן בחר "אישור".
      5. שמור את תמונת המונטאז' המתקבלת של כל אזור העניין כקובץ TIFF.

חומרים