הדמיה של הפעלה עצבית בהיפוקמפוס בקטעי מוח של עכבר

תקציר

מקור: Provenzano, G., et al. ויזואליזציה אימונוהיסטוכימית של פעילות נוירונים בהיפוקמפוס לאחר למידה מרחבית במודל עכבר של הפרעות נוירו-התפתחותיות. J. Vis. Exp. (2015)

סרטון זה מדגים הדמיה אימונוהיסטוכימית כדי להמחיש הפעלה עצבית בהיפוקמפוס. חלקי מוח מוכתמים חושפים אזורים כהים יותר תחת מיקרוסקופ שדה בהיר, מה שמעיד על נוירונים מופעלים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. אימונוהיסטוכימיה

1. העבירו 3-5 קטעי היפוקמפוס גביים לכל עכבר ל-24 צלחות מרובות בארות המכילות 500 מיקרוליטר של 0.1 M תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS) לכל באר.
2. שוטפים את החלקים הכלולים בכל באר עם 500 מיקרוליטר של 0.1 M PBS (5 דקות, 3 פעמים בניעור עדין).
3. להרוות את פעילות הפרוקסידאז האנדוגנית על ידי דגירה של קטעים במי חמצן 1% (H₂O₂) ב-PBS למשך 20 דקות עם תסיסה עדינה.
4. שטפו חלקים ב-0.1 מ' PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
5. חדירות של רקמות: דגירה של קטעים למשך 5 דקות ב-0.2% Triton X-100 ב-PBS.
6. במהלך השלבים לעיל (1.4; 1.5), צור מספיק מאגר חוסם (10% סרום עיזים ו-0.1% טריטון-X100 ב-PBS) לכל הניסוי (מספר חלקים x 100 מיקרוליטר x 3 שלבים).
7. הערה: השתמש בנסיוב מאותו המין שבו נוצר הנוגדן המשני (Ab) (מצומד לביוטין).
8. מנע קשירה לא ספציפית של הנוגדן על ידי דגירה של קטעים במאגר חוסם (100 מיקרוליטר / חתך) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) עם תסיסה עדינה.
9. דגירה של קטעי קינאז מווסת אות חוץ-תאי זרחני ראשוני (pERK) מדולל במאגר חוסם למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, עם תסיסה עדינה.
10. שטפו חלקים ב-0.1 מ' PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
11. דגירה עם הבטן המשנית המצומדת עם ביוטין (1:250) מדולל במאגר חוסם (זהה לזה ששימש בשלב 1.6) למשך שעה אחת ב-RT עם תסיסה עדינה.
12. הכן את המגיב של קומפלקס אבידין-ביוטין (ABC) במקביל, שכן אבידין וביוטין דורשים לפחות 30 דקות בטמפרטורת החדר כדי להרכב.
13. הכן את הנפח הנדרש של מגיב ABC בהתאם לפרוטוקול היצרן.
14. שטפו חלקים ב-0.1 מ' PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
15. דגירה של קטעים למשך 45 דקות ב-RT עם ABC Reagent.
16. שטפו חלקים ב-0.1 מ' PBS עם תסיסה עדינה (3 x 5 דקות).
17. כדי להכין פתרון עבודה דיאמינובנזידין (DAB), כל שלב הכרוך ב-DAB חייב להיעשות במכסה האדים, מכיוון ש-DAB הוא מסרטן וטרטוגני.
18. העבירו את תמיסת ה-DAB לצלחת חדשה עם פיפטת העברה מפלסטיק.
19. הנח חלקים בצלחת המכילה את תמיסת העבודה DAB וסובב לאט את הצלחת ביד כדי לאפשר חשיפה מקסימלית לחלקים.
20. עקוב אחר תגובת DAB במיקרוסקופ עד להתפתחות אות מתאים (2-5 דקות).
21. עצור את התגובה בעוצמת הצבע הרצויה על ידי שטיפת הרקמה ב-0.1 M PBS (3 x 5 דקות).
22. השתמש באקונומיקה כדי להשבית כל תמיסת מצע DAB שנותרה במכסה האדים למשך הלילה והשליך אותה בהתאם להנחיות המעבדה.
23. הרכיבו מקטעים על שקופיות מצופות ג'לטין על ידי הצפתם ב-PBS. לאחר מכן, יבש אותם בטמפרטורת החדר למשך 3-4 שעות לפחות.
24. יש לייבש את החלקים ברצף ב-50%, 70%, 95% ו-100% אתנול למשך 2 דקות כל אחד ולנקות ב-100% קסילן למשך 5 דקות.
25. החליק את הכיסוי באמצעות מדיום הרכבה והשאיר במכסה אדים לייבוש למשך הלילה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
24 well plate	Sigma	CLS3524
100% אתנול	Fisher Scientific	A406-20	משמש לייצור שיפוע אתנול להתייבשות לפני הרכבת החלקה.
Xylene	VWR	66004-950	Toxic - לשימוש מתחת למכסה המנוע. החלף קסילן כל חודש בהתאם לשימוש.
PBS	Sigma	P3813-10PAK
Triton X-100	Sigma	T-8787
מי חמצן	Sigma	H1009-100ML
Normal goat serum	Abcam	G9023-10ML
ABC kit Vectastain	Vector Laboratories	PK-6100	הוסף נפח של 5 מ"ל PBS 2 טיפות מגיב A, ערבב ולאחר מכן הוסף 2 טיפות מגיב B וערבב.
DAB peroxidase Substrate	Vector Laboratories	SK-4100	הוסף נפח של 5 מ"ל מים מזוקקים כפולים: 2 טיפות תמיסת מלאי חיץ וערבב; 4 טיפות DAB וערבב; 2 טיפות מי חמצן וערבב.
pERK antibody	Cell Signaling Technologies	4370	דילול 1:500
biotinylated goat anti-rabbit IgG anti-rabbit	Vector Laboratories	BA-1000	דילול 1:250
SuperFrost Slides	Carl Roth	1879
Coverslips	Fisher	12-548-B
DPX	Sigma	317616	אמצעי הרכבה לשקופיות. ניתן להשתמש באמצעי הרכבה שווה ערך.