הדמיית דינמיקת ATP תוך-תאית באמצעות חיישנים מבוססי FRET בפרוסת היפוקמפוס אורגנוטיפית של עכבר

תקציר

מקור: Lerchundi, R., et. al. הדמיה של ATP תוך-תאי בפרוסות רקמה אורגנוטיפיות של מוח העכבר באמצעות חיישן מבוסס FRET ATeam1.03YEMK. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים את השימוש בחיישנים מבוססי FRET (העברת אנרגיה בתהודה פלואורסצנטית) למדידת רמות ATP תוך-תאיות בפרוסות היפוקמפוס אורגנוטיפיות של עכבר, מה שמאפשר הדמיה בזמן אמת של דינמיקת ATP בתאי עצב ואסטרוציטים בתנאים פיזיולוגיים וניסיוניים.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. הדמיית ATP מבוססת FRET ( איור 1)

1. לפני הניסוי, הכינו E-ACSF ובעבעו אותו עם 95% O₂/5% CO₂ למשך 30 דקות לפחות כדי לקבל pH של 7.4. הפעל את מקור האור הפלואורסצנטי (קסנון lamp) של המונוכרומטור (איור 1). התחל את הזלוף רגע לפני שמוציאים את הפרוסה מהחממה.
   הערה: שמור על מי מלח מבעבעים עם 95% O₂ ו-5% CO₂ במהלך כל הניסוי.
2. העבירו את הפרוסה לתוך תא ניסוי שמתמלא כל הזמן ב-E-ACSF טרי באמצעות משאבה פריסטלטית (איור 1). לאחר מכן, תקן את הפרוסה ברשת. הנח את החדר על המיקרוסקופ stage וחבר את מערכת הזילוף. צינורות מעבדה חסיני גז מומלצים לזילוף.
   הערה: ניתן לבצע ניסויים בטמפרטורת החדר או בטמפרטורה קרובה לפיזיולוגית, בהתאם לתכנון הניסוי. בדוק את היציבות והאמינות של זרימת הזלוף כדי למנוע שינויי מיקוד הנגרמים מתנועת הרקמה ו/או שינויים במתח הגזירה. מהירויות הזלוף הסטנדרטיות לעבודת פרוסות, המשמשות אותנו ומעבדות רבות אחרות, הן 1.5-2.5 מ"ל/דקה.
3. הבא את הפרוסה המתורבתת למיקוד באמצעות נורת שידור. זהה את האזור בו יבוצעו ניסויים (לדוגמה: אזור CA1 בהיפוקמפוס). לפני שתתחיל בניסויי הדמיה, המתן לפחות 15 דקות כדי לאפשר לפרוסות להסתגל לתנאי המלח. לתצורה של מערך הניסוי, ראה איור 1.
4. הפעל את המצלמה ואת תוכנת ההדמיה. לאחר מכן, בחר את קוביית הסינון המתאימה.
5. לעורר את החלבון הפלואורסצנטי התורם (eCFP) ב-435/17 ננומטר (~435 ננומטר). הגדר את זמן החשיפה בין 40 ל-90 אלפיות השנייה.
   } הערה: חשיפה חזקה של פרוסות לאור הפלואורסצנטי עלולה לגרום להשפעות פוטוטוקסיות.
6. עירור ב-435 ננומטר מביא לפליטה הן ב-475 ננומטר (eCFP; תורם) והן ב-527 ננומטר (נוגה; מקבל). פצל את פליטת הקרינה ב-500 ננומטר עם מפצל תמונת פליטה והשתמש במסנני פס פס ב-483/32 ו-542/27 כדי לבודד עוד יותר את הקרינה של התורם והמקבל. ביטוי חזק עלול לגרום לרוויה של הגלאים. במקרה זה, אתה עשוי להשתמש במסנן צפיפות ניטרלי כדי להפחית את עוצמת העירור.
7. בחר אזור עניין (ROI) שככל הנראה נטול פלואורסצנטיות תאית להפחתת רקע. לאחר מכן, צור החזר ROI התוחם גופי תאים.
8. הגדר את תדירות רכישת התמונה ואת זמן ההקלטה הכולל. לניסויים ארוכים (>30 דקות), מומלץ תדר רכישה של 0.2-0.5 הרץ כדי למנוע פוטוטוקסיות.
9. התחל את ההקלטה. מומלץ להקליט לפחות 5 דקות בתנאי בסיס כדי להבטיח את יציבות התכשיר.
   הערה: כוונן את המיקוד של התא במהלך ההקלטה במידת הצורך.

תוצאות

איור 1: תצורה של מערך ההדמיה של FRET. (A) המחשה סכמטית של הרכיבים השונים והסידור המרחבי שלהם הנדרש למערך ההדמיה של FRET. הסידור מורכב ממונוכרומטור עם מנורת קסנון כמקור אור, מיקרוס...

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
2-deoxyglucose	Alfa Aesar	L07338	אנלוגי גלוקוז שאינו ניתן לחילוף חומרים
מסנני מעבר פס 483/32	AHF Analysentechnik AG		מסנן
מסנני מעבר פס 542/27	AHF Analysentechnik AG		מסנן פליטה תואם מפצל
Beamsplitter T 455 LP	AHF Analysentechnik AG		Excitation dichroic mirror
Beamsplitter T 505 LPXR	AHF Analysentechnik AG		Splitter dichroic
עיבוד נתונים Origin Pro 9.0.0 (64- bit)	OriginLab corporation		Scientific graphing and data analysis software
D-glucose monohydrate	Caelo	2580-1kg
DPBS	GIBCO/Life	14190250	Dulbecco's phosphate-buffered salt
Eclipse E 600FN מיקרוסקופ זקוף	Nikon Microscope Solutions
Eclipse FN1 upright microscope	Nikon Microscope Solutions
Experimental chamber	custom build		תא זלוף להדמיית
תמיסת מלח מאוזנת של הנקס<	H9394	עם פנול אדום לניטור pH
Minimum Essential Medium Eagle	Sigma-Aldrich	M7278	Synthetic Cell Culture media	Monochromator Polychrome V	Thermo Scientific/FEI		Ultra fast
Nikon Fluor 40x / 0.80 W DIC M ∞/0 WD 2.0	Nikon Microscope Solutions		water immersion microscope Objective
NIS Elements 4.50 Advanced Research	Nikon Microscope Solutions		תוכנת הדמיה. גרסה משודרגת להדמיית FRET
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics		Digital CMOS camera	Perfusion tubing	Pro Liquid GmbH		Tygon tubing, 1.52 x 322 מ"מ (Wd: 0.85)
Photoshop CS 6 Version 13.0	Adobe		תוכנת עיבוד
ssAAV-2/2-hSyn1-ATeam1.03YEMK-WPRE-hGHp(A)	ETH Zürich	v244	וקטור AAV חד-גדילי המשרה את הביטוי של ATeam1.03YEMK בשליטת שבר מקדם סינפסין 1 האנושי hSyn1.
ssAAV-5/2-hGFAP-hHBbI/E-ATeam1.03YEMK-WPRE-bGHp(A)	ETH Zürich	v307	וקטור AAV חד-גדילי הגורם לביטוי של ATeam1.03YEMK תחת שליטת מקדם החלבון החומצי הסיבי של גליה אנושית ABC1D.

פליטה תואם מפצל תאים חייםtd style='width:119pt;'>Sigma-Aldrich מיתוג מונוכרומטור תמונה