סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית רשתית in vivo באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. עכברים מורדמים מוכנים להדמיה על ידי אבטחת ראשם, מריחת חומר סיכה לעיניים והנחת כיסוי על העין. תאי גנגליון רשתית (RGCs) המבטאים חלבונים פלואורסצנטיים מוצגים לראשונה באמצעות אפיפלואורסצנציה ליישור. לבסוף, נעשה שימוש בהדמיה דו-פוטונית, המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה של RGCs.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיית שני פוטונים in vivo של רשתית העכבר
1.8K צפיות
⸱
28 באפריל 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת עכבר לרכישת
- תמונהעכבר מרדים להדמיה<br />הערה: כדי להפחית את החשיפה לאיזופלורן, יש להקפיד על ניקוי נכון של גזי פסולת. ודא שיציאת הפליטה של תא האינדוקציה של ההרדמה מחוברת למיכל מסנן גז נבלות פסיבי ושקע האף של ההרדמה של העכבר מחובר למיכל מסנן גז פעיל עם ואקום המסופק על ידי מכשיר פינוי גז. פעל לפי הנחיות היצרן לניטור משקל מיכל המסנן להחלפה.
- הרדים את העכבר באמצעות קוקטייל קטמין/קסילזין. לחלופין, יש לגרום להרדמה באמצעות שאיפת איזופלורן אם משתמשים גם באיזופלורן לשמירה על ההרדמה (מפגש הדמיה > 30 דקות). הגדר את מכשיר ההרדמה לבעלי חיים קטנים כדי למלא את תא האינדוקציה ב-5% איזופלורן מעורבב עם אוויר החדר בקצב זרימה של 0.5 ליטר לדקה. הנח את העכבר בתא האינדוקציה, ואפשר 15 שניות לעכבר להיות מורדם.
- העבר את מכשיר האידוי איזופלורן ל-0% והפנה את זרימת ההרדמה לאף. בצע שטיפה של 5 שניות "O2" של תא האינדוקציה. הוצא את העכבר מתא האינדוקציה, ואבטח אותו במחזיק הראש, והצמד את האף.
- השתמש בתערובת של 1% איזופלורן עם אוויר בחדר בקצב זרימה של 0.5 ליטר לדקה לשמירה על ההרדמה. עקוב אחר קצב הנשימה במרווחים של 5 דקות לאורך כל ההרדמה, והתאם את אחוז האיזופלורן כדי לשמור על קצב נשימה של ~60 נשימות לדקה.
הערה: הגדרות אלה (% איזופלורן, קצב זרימה) יכולות לשמש גם לשמירה על הרדמה הנגרמת על ידי קוקטייל קטמין/קסילזין.
- הרחבת אישון
- הכן תמיסה של 1% w/v אטרופין ו-2.5% w/v פנילפרין הידרוכלוריד במים. אחסן את תמיסת ההרחבה בטמפרטורת החדר מוגנת מפני אור.
- בעזרת טפטפת עיניים חד פעמית, מרחו טיפה מתמיסת ההרחבה על כל עין שתצולם. כבו את אורות החדר והמתינו 5 דקות עד שהאישון יתרחב. כאשר האישון מורחב, מחק את תמיסת המרחיב ברקמה נטולת מוך.
הערה: ודא שתמיסת המרחיב לא נכנסת לנחיריים. - מרחו טיפה גדולה של ג'ל עיניים סיכה על כל עין שתצולם. אם יש לצלם את שתי העיניים, יש למרוח חתיכה קטנה של ניילון נצמד מפלסטיק על ג'ל העיניים על העין שאינה מצלמת כדי למנוע התייבשות. אם אתה מצלם רק עין אחת, יש למרוח משחת עיניים סיכה על העין שלא תצולם.
- מיקום עכבר להדמיה
- כדי לאבטח את העכבר במחזיק ראש ההדמיה, סובב את הזרוע הראשית של מחזיק הראש עד שמוט האפרכסת מוטה בזווית של 60° או יותר מתחת לאופקי. אבטח את סיכת תעלת האוזן התחתונה במצב המורחב פנימה ואת סיכת תעלת האוזן העליונה במצב נסוג.
- כשהעכבר פונה למוט הנשיכה, הרכיב אוזן אחת על הסיכה התחתונה המורחבת, והכנס את הסיכה לתעלת האוזן. שחרר את הבורג המאבטח את סיכת תעלת האוזן העליונה, והאריך את הסיכה לתוך תעלת האוזן השנייה. הדק את הבורג כדי לאבטח את הראש.
- החלק את סרגל הנשיכה לכיוון ראש העכבר. הרם בעדינות את ראש העכבר, ולאחר מכן הורד את החותכות המקסילריות של העכבר לתוך החור של מוט הנשיכה. משוך את מוט הנשיכה בכוח עדין כדי לאבטח את ראש העכבר, ואבטח את מיקום מוט הנשיכה על ידי הידוק הבורג.
- אם אתה משתמש באיזופלורן, החלק את האף דרך החריץ שלו על מוט הנשיכה לפני אבטחת החותכות של העכבר. אבטח והדק את מיקום מוט הנשיכה כמו בשלב 1.3.3. הדק את האף באמצעות שני הברגים בפניו העליונים עד שהוא נכנס היטב לאף העכבר, אך אינו מכווץ את החוטם.
- העבר את העכבר, במחזיק הראש, לשלב המיקרוסקופ מתחת למטרה. סובבו את הזרוע הראשית של מחזיק הראש עד שאישון העין מכוון ישר כלפי מעלה, בקו אחד עם נתיב האור (איור 1).
- הנח כיסוי #1.5 במחזיק המסנן הקומפקטי והצמד את המחזיק למיקרוסקופ stage. הורידו את הכיסוי לכיוון העין, תוך יצירת קשר עם ג'ל העיניים של חומר הסיכה, כך שהוא מונח אופקית ממש מעל הקרנית (איור 1). ודא שהחלקת הכיסוי אינה נוגעת בקרנית.
הערה: במיקרוסקופ, ודא שנתיב אור העירור מוגדר לאפיפלואורסצנציה ונתיב אור הפליטה מוגדר לעינית. הפעל את תאורת האפיפלואורסצנציה בעוצמתו הנמוכה ביותר ופתח את תריס התאורה. בחר את אורך הגל של מאיר האפיפלואורסצנטי ואת מסנן הקרינה המתאימים לפלואורופור המצולם. - תמרן את ה-stage במידות ה-XY והמטרה במצב Z באמצעות בקרת ה-stage וכונן המיקוד הממונע עד שנורית עירור השדה הרחב מכסה את הקרנית במלואה. בהסתכלות דרך העינית, המשך לכוונן את מיקום ה-Z של השלב עד שהתאים הפלואורסצנטיים או המבנים ברשתית ייכנסו לפוקוס. הגדל את עוצמת התאורה של אפיפלואורסצנציה אם אות הדגימה אינו בהיר מספיק כדי לפתור תאים בודדים או מבנים מעניינים דרך העינית.
הערה: אם מתקשים לאתר את הרשתית, הקשתית היא נקודת ציון בעלת ניגודיות גבוהה לעגון עליה ואז להתמקד כלפי מטה לכיוון הרשתית. שלב זה יאפשר גם אימות שהאישון מורחב בצורה מקסימלית. - השג אזור הדמיה על הציר עם עדשת העכבר. כוונן את זווית העכבר באמצעות דרגות החופש השונות במחזיק הראש עד להתרחבות או התכווצות של אור שאינו ממוקד רק בעת כוונון מישור המוקד. כבה את תאורת האפיפלואורסצנציה וסגור את תריס התאורה.
הערה: פרלקסה משמעותית של X-Y של אור לא ממוקד בזמן גלילה דרך מישורי המוקד בכיוון Z מצביעה על כך שהרשתית אינה על הציר ביחס לנתיב אור ההדמיה.
2. רכישת
- תמונה דו-פוטוניתפרמטרים להגדרת תמונה ורכישה
הערה: כבה את אורות החדר וכסה מקורות אור תועים בחדר. ודא שמאיר האפיפלואורסצנטי כבוי, ותריס התאורה סגור.- העבר את נתיב אור העירור ללייזר ואת נתיב האור הפליטה לצינורות מכפיל הפוטו (PMTs).
- בתוכנת רכישת התמונות, הגדר גודל מסגרת של 512 x 512 וממוצע מסגרת של 3. הגדר את השלבים לפרוסה ל -8 מיקרומטר. ייעד צעד z כדי להתחיל בחלק העליון של הערימה ולהתקדם כלפי מטה, תוך מזעור הפעלת לייזר דו-פוטוני של קולטני אור.
הערה: ניתן להקטין את גודל הצעד כדי להגדיל את רזולוציית Z במחיר של זמן הדמיה מוגבר, אך 8 צעדים של מיקרומטר מספיקים כדי לפתור סומטה של תאים בתצורת הדמיה זו. - הפעל והפעל את ה-PMT. כוונן את מתח ה-PMT ל-680 V. הפעל את תריס העירור.
הערה: PMTs מופעלים רגישים לנזקי אור. ודא שתאורת האפיפלואורסצנטי כבויה, וילון מארז המיקרוסקופ נמשך ואורות החדר כבויים. - התחל תצוגה מקדימה של תמונה חיה של רקמת המטרה, החל מ-1% עוצמת לייזר. כוונן אוטומטית את בהירות התצוגה כדי להציג באופן חזותי את התאים או המבנים המעניינים. כוונן אוטומטית את שלב הסריקה. אם רקמת המטרה עמומה או לא ברורה, הגדל את אחוז הספק הלייזר עד שהמבנים נראים מבלי לחרוג מהגבול שנקבע בשלב 2.4.4, המתאים ל-45 mW.
הערה: עבור תמונה של 16 סיביות, ערך תצוגה של ~1000 בעת התאמה אוטומטית של בהירות במישור Z המכיל מבנים מעניינים מצביע על בהירות מספקת של הדגימה. - תמרן את שלב המיקרוסקופ בכיוון X-Y כדי להתרכז באזור הדמיה רצוי, ולאחר מכן נווט למישור Z עם המבנים המעניינים במיקוד.
הערה: הדמיה בסמוך לראש עצב הראייה מאפשרת לו לשמש נקודת ציון חד משמעית לניסויי הדמיה כרוניים. - אם מדובר בניסוי כרוני בהילוך מהיר, פתח תמונה קודמת במחשב הרכישה והשתמש בה כהפניה כדי למצוא את אותו תחום עניין. ודא שזווית ההדמיה דומה לזו של תמונות קודמות כדי לרכוש את אותה קבוצת תאים עם פרלקסה מינימלית.
הערה: כדי לדמות את אותם תאים כמו בנקודות זמן קודמות (איור 2), סביר להניח שתידרש התאמה נוספת של מיקום ראש העכבר. - הגדר את גבולות ה-Z של מחסנית ההדמיה על-ידי ניווט למישורי ה-Z העליונים והתחתונים ביותר המעניינים, וקבל את התמונה. עם השלמת רכישת התמונה, השבת את ה-PMT ואת תריס הפליטה. העבר את נתיב אור הפליטה בחזרה לעינית, ואת נתיב אור העירור לתאורת אפיפלואורסצנטית. הסר את העכבר משלב המיקרוסקופ.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
איור 1: מיקום עכברים להדמיה in vivo. כדי למקם את העכבר עם האישון על הציר עם נתיב האור, העכבר המורדם מרוסן תחילה במחזיק ראש, הראש מסובב וזוויתי, טיפה גדולה של ג'ל עיניים סיכה מונחת על העין והעכבר מונח על הבמה. כיסוי מותקן במחזיק הכיסוי בניצב לנתיב האור ומוריד כלפי מטה לכיוון העין. הכיסוי לא אמור ליצור קשר עם הקרנית או ראש העכבר (משמאל), מה שיהיה ניכר...
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| #1.5 coverslip | ThermoFisher | 152440 | Richard-Allan #1.5 24 מ"מ x 40 מ"מ |
| 50 מ"ל מזרק זכוכית | המילטון | 80950 | 22G מחט מלט |
| משאבת אוויר הרדמה | RWD מדעי החיים | R510-30 | |
| אטרופין | סיגמא | A0132 | לתמיסת מרחיב אישון |
| מכשיר הרדמה בסיסי לבעלי חיים קטנים RWD Life Science R500IE | נימי זכוכית בורוסיליקט Sutter B150-86-10 | ||
| קוטר חיצוני 1.50 מ"מ, קוטר פנימי 0.86 מ"מ, אורך 10 ס"מ | |||
| קוביית מסנן CFP/YFP | Chroma | מותאם אישית | 480/40, 505 מעבר ארוך, 535/30 |
| ChromoFlex - יחידת זיהוי PMT דו-ערוצית | Scientifica | S-MPLG-1002 | |
| משאבת חימום במחזור | Braintree Scientific | tp-700 מוגדר ל-37 | מעלות צלזיוס |
| סרט נצמד | VWR | 10713-916 | |
| מחזיק מסנן קומפקטי | ThorLabs | DH1 | מחזיק כיסוי מעל עין |
| Cx3cr1-GFP עכברים טרנסגניים (B6.129P2(Cg)-Cx3cr1tm1Litt/J) | The Jackson Laboratory | 5582 | |
| שלדת בקר DAQ | National Instruments | PXIe-1073 | |
| מכשיר לרכישת נתונים | National Instruments | BNC-2090A | |
| מודול FPGA עם דיגיטייזר | National Instruments | NI-5734 | |
| מכשיר פינוי גז | RWD Life Science | R546W | |
| GenTeal Severe חומר סיכה ג'ל | עיניים Alcon | (מבית מרקחת מקומי) | לשימוש במהלך הדמיה |
| GFP/Red filter cube | Chroma | custom | 535/30, 560 long pass, 605/70 |
| כרית חימום | McKesson Medical and Surgical | 190147 | |
| HyperScope Launch Optics לשימוש עם Pockels Cell | Scientifica | S-MP-101080 | |
| מודול ראשי של HyperScope | Scientifica | S-MP-100466 | |
| HyperScope Scan Path | Scientifica | S-MP-100406 | |
| HyperScope X galvo Module | Scientifica | MP-100443 | |
| ImageJ תוכנת | פיג'יתוכנה | ||
| Isoflurane | Patterson Veterinary | NDC 14043-704-06 | |
| מיכל מסנן גז איזופלורן (נבלות פעילות) | RWD Life Science | R510-31 | |
| מיכל מסנן גז איזופלורן (נבלות פסיביות) | RWD Life Science | R510-31S | |
| קטמין הידרוכלוריד (100 מ"ג/מ"ל) | Vedco | NDC 50989-161-06 | |
| מתאם M32 ל-M26 | ThorLabs | M32M26S | |
| MaiTai GUI software | Spectra-Physics | NA | |
| MATLAB software | MathWorks | NA | R2015b |
| meloxicam (5 mg/mL) | Boehringer Ingelheim | NDC 0010-6013-01 | Analgesic |
| Micorscope Objective | Edmund Optics | 46-404 | Mitutoyo WE715042319 |
| חולץ מיקרופיפטה | Sutter | Flaming/Brown דגם P-97 | |
| שמן מינרלי | פישר | BP2629-1 | |
| מיני בולדוג מהדק המוסטטי | Fine Science Tools | 18053-28 | |
| צינורות EVA מיניאטוריים 0.02 אינץ' ID, 0.06 אינץ' OD | McMaster Carr | 1883T1 | |
| צינורות EVA מיניאטוריים 0.05 אינץ' ID, 0.09 אינץ' OD | McMaster Carr | 1883T4 | |
| מחזיק ראש עכבר | Narishige | SGM-4 | |
| מס' 5 מלקחיים | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Optic Posts 1/2" | ThorLabs | TR3-P5 | |
| ערכת מד כוח אופטי | ThorLabs | PM100D | |
| pE-300 Ultra LLG Deivery Scientifica | COO-LED3ULLGs | ||
| Phenylephrine hydrochloride | Sigma | P6126 | לתמיסת מרחיב אישונים |
| Pockels cell Conoptics 350-80-02 | Pockels cell ampliifier Conoptics Model 302RM | Proparacaine hydrochloride Sigma | |
| 1571001 | לקיבוע | ||
| מסנן מעבר קצר אדום ואדום רחוק Cube | Chroma | מותאם אישית | 560 מעבר |
| מסתובב 1/2 אינץ' מהדק פוסט | ThorLabs | SWC | |
| ScanImage, חבילת | Vidrio Technologies | , תוכנה חינמית | לרכישת תמונות; גרסה 5.4.0 (2018); דורש MATLAB |
| תמיסת נתרן כלורי, סטרילית (0.9%) | Fresenius Kabi | NDC 63323-186-01 | |
| סטריאומיקרוסקופ | Leica | S9 E | |
| צנטריפוגה שולחנית | Oxford | Benchmate C8 | |
| Terramycin oxytetracycline/polymyxin B antibiotic משחה עיניים | Zoetisus | NA | לשימוש לאחר הזרקה |
| מערכת קירור ThermoRack | מערכות קירור מצב מוצק | ThermoRack 401 | מוגדר ל-20°C |
| Ultrafast Ti:Sapphire | laser Spectra-Physics | Mai Tai DeepSee | |
| Vgat-Cre עכברים טרנסגניים (Slc32a1tm2(cre)Lowl/J) | מעבדת ג'קסון | 16962 | |
| VGlut2-Cre עכברים טרנסגניים (Slc17a6tm2(cre)Lowl/J) | מעבדת ג'קסון | 16963 | |
| VivoScope for In Vivo Imaging | Scientifica | S-MPVS-1200-00P | |
| שמן סיכה שמן מינרלי לבן משחת עיניים | Stye | NA | עבור שימוש לאחר הדמיה |
| קסילזין הידרוכלוריד (20 מ"ג/מ"ל) | Akorn | NDC 59399-110-20 |
