הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקה נוירו-אימונית באמצעות שתל גולגולת

תקציר

מקור: Bisht, K., et al. מיפוי מוח מדויק לביצוע הדמיה חוזרת של דינמיקה נוירו-אימונית בעכברים. J. Vis. Exp. (2020)

סרטון זה מדגים הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקה נוירו-אימונית בעכבר טרנסגני עם שתל גולגולת. יציבות כלי הדם והעצבים מצולמת לצד שינויים דינמיים במיקרוגליה, המשקפים תגובות חיסוניות לפעילות עצבית.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת עכבר להשתלת חלון גולגולת

הערה: קווי עכבר טרנסגניים שונים עם תגים פלואורסצנטיים מתאימים להדמיה.

1. השתמש בעכברי CX3CR1GFP/+ כדי לדמיין מיקרוגליה in vivo. בדרך כלל, משתמשים בעכברים צעירים עד בוגרים צעירים בני 4 עד 10 שבועות במשקל 17-25 גרם.
   הערה: למרות שגישה זו מתאימה אפילו לעכברים שנגמלו מראש, הצורך להחזיר את העכברים לכלובים שלהם עם אמותיהם להאכלה עלול לסבך את ההחלמה אם האם לא מטפלת כראוי בגורים לאחר הניתוח. לכן, מומלץ להשתמש בעכברים לאחר הגמילה.
2. להרדים את העכבר באמצעות איזופלורן (5% זרימה בחמצן לאינדוקציה למשך דקה) בתא הרדמה. בדוק שהעכבר אינו מראה תגובות תנועה או עוויתות לצביטות בבוהן ו/או בזנב. הוציאו את העכבר מהתא ובאוויר הפתוח גלחו היטב את שיער הראש בין האוזניים בערך מגובה העיניים ועד לחלק העליון של אזור הצוואר בעזרת גוזם שיער.
   הערה: ריכוז האיזופלורן בשימוש יהיה תלוי בגודל תא האינדוקציה. לכן, עבור תאים קטנים יותר, ניתן להשתמש ב-3-4% איזופלורן כדי לגרום להרדמה יעילה, בעוד שתאים גדולים יותר ידרשו עד 5%.
3. העבר את העכבר לקונוס האף של תחנת הניתוח הסטריאוטקטית להרדמה (1.5-2% לתחזוקה במהלך הניתוח), ייצב את ראשו באמצעות מוטות אוזניים, והשאר את העכבר על כרית חימום כדי לשמור על טמפרטורת גופו חמה.
4. יש לשמן את שתי העיניים במשחת עיניים. יש להזריק 100 מיקרוליטר של 0.25% בופיבקאין (כדי לספק משככי כאבים מקומיים לעכבר שיימשכו 8-12 שעות) ו-100 מיקרוליטר של 4 מ"ג/מ"ל דקסמתזון (כדי להפחית את הדלקת שעלולה לנבוע מהליך הניתוח) תת עורית במקום החתך. אפשר לעכבר לשבת לפחות 5 דקות לפני המעבר לשלב הבא.
5. נקו את הראש המגולח עם שלוש ספוגיות לסירוגין של בטדין ו-70% אלכוהול. בעזרת להב כירורגי או מספריים, בצע חתך בקרקפת בקו האמצע המשתרע מהחלק האחורי של אזור הגולגולת בין האוזניים לאזור הקדמי בין העיניים. העור שנותר נחתך כדי לחשוף את הגולגולת.
6. נקו את רקמת החיבור הממוקמת בין הקרקפת לגולגולת שמתחתיה עם 3% מי חמצן (H₂O₂)} ולוקליזציה של אזור המוח כך שיצולם עם קואורדינטות סטריאוטקטיות.
   הערה: לעתים קרובות יש דימום מסוים (שלב 1.5) מהחתך על פני הגולגולת. דימום זה בדרך כלל נפתר מעצמו תוך 3-5 דקות. ניקוי עם מי חמצן עוזר. טיפול קודם בבופיבקאין (שלב 1.4) צוין גם כמגביל את כמות הדימום במהלך תקופה זו.

2. ניתוח השתלת חלון גולגולת בעכבר

1. קדחו פתח עגול ~4 מ"מ לתוך הגולגולת באמצעות מקדח דנטלי (קוטר קצה 0.7 מ"מ) והסירו בזהירות את החלק הזה של הגולגולת באמצעות מלקחיים מחודדים. להדמיית קליפת המוח הסומטוסנסורית של עכברים בני 6-8 שבועות, אתר את מרכז הגולגולת ב-2.5 אחורי ±-2.0 לרוחב לברגמה. במהלך הקידוח, הרטיבו את הגולגולת באופן קבוע עם מי מלח סטריליים וצמר גפן כדי לקרר את המוח, לנקות פסולת עצם ולרכך את עצם הגולגולת להסרה בסופו של דבר.
   הערה: הקואורדינטות של הגולגולת ישתנו בהתאם לאזור העניין ולגיל העכברים.
2. לאחר הסרת הגולגולת, הניחו בזהירות כוס כיסוי קטנה (גודל #0 בעובי 0.1 ± 0.02 מ"מ) לחה במי מלח בגולגולת. יבש עודפי מלח באמצעות מגבון סטרילי.
3. בעזרת מוליך מחודד (כגון קצה פיפטה או קצה מחודד של צמר גפן מעץ שבור), מרחו את דבק הציאנואקרילט סביב החלון ואפשרו לו להיצמד למוח ולגולגולת. מרחו את דבק הפריימר על שאר הגולגולת ורפא אותו באור ריפוי למשך 20-40 שניות. הכינו באר סביב החלון עם הדבק הסופי ורפאו בעזרת אור ריפוי של 20-40 שניות.
4. הדביקו לוחית ראש קטנה על הגולגולת בחצי הכדור הנגדי של הגולגולת תחילה עם דבק הפריימר כפריימר ולאחר מכן עם הדבק הסופי. רפאו את שניהם עם אור הריפוי למשך 20-40 שניות כל אחד.
   הערה: תפרים אינם נחוצים אם הגולגולת מכוסה בדבק במהלך הליך זה.

3. טיפול לאחר הניתוח

1. אפשרו לעכבר להתעורר ללא הרדמה (התאוששות שנעשית על כרית חימום מקצרת את זמן ההחלמה) והחזירו אותו לכלוב הביתי שלו לאחר התעוררות מלאה. יש להזריק מנה תת עורית אחת של בופרנורפין SR (0.5 מ"ג/ק"ג) כמשכך כאבים לאחר הניתוח המספיקה ל-72 שעות.
2. } כדי להקל על החלמה בריאה מהניתוח, ספק לעכבר מזון רך במיוחד, כגון צ'או מוצק רגיל שהושרה במים כדי לרכך אותו או מזון בצורת ג'ל.
   הערה: אספקה חד פעמית של מזון רך מיד לאחר הניתוח מספיקה.
3. עקוב אחר העכבר מדי יום לבריאות והתאוששות תקינה במשך 72 השעות הראשונות של הליך הניתוח. לאחר מכן, הדמיה מניתוח השתלת החלון תבוצע כבר שבועיים.
   הערה: אם עושים זאת היטב, עכברים מתאוששים היטב ומראים התנהגויות אמבולטוריות, חקר כלוב מספיק, הידרציה טובה, עלייה יציבה במשקל ואינטראקציות נרחבות עם עכברים אחרים בכלוב ופריטים אחרים בכלוב. עכברים המראים עייפות, התייבשות וירידה של יותר מ-10% במשקל לאחר הניתוח מורדמים ומוסרים מהמחקר.

4. מיפוי מוח דו-פוטוני להדמיה ראשונית

1. הרדמת העכבר (איזופלורן, 5% אינדוקציה ו-1.5% תחזוקה). ייצב את הראש באמצעות ברגים כדי להרכיב את לוחית הראש על המיקרוסקופ הדו-פוטוני stage, תוך שמירה על צלחת חימום ב-35 מעלות צלזיוס.
   הערה: הדמיה יכולה להיעשות גם בעכברים ערים ללא הרדמה. עם זאת, מחקרים אחרונים מצביעים על כך שהרדמה משפיעה על דינמיקת המעקב אחר מיקרוגליה. קיבוע ראש להדמיה דו-פוטונית בעכברים ערים מגביר את הלחץ גם במהלך הדמיה כרונית למשך 25 יום לפחות.
2. נקו את פני חלון הגולגולת בעדינות באמצעות צמר גפן טבול באתנול 70%. שים כמה טיפות מים או מי מלח על חלון הגולגולת והורד את עדשת האובייקט לתמיסה מכיוון שהמטרה היא עדשת טבילה.
3. צייר ביד מפה גסה כדי לציין את ציוני הדרך העיקריים של כלי הדם במחברת מעבדה תוך התבוננות דרך העינית על ידי אפיפלואורסצנטיות. השתמש בציור זה כדי לזהות את האזורים הספציפיים במהלך הדמיה של שני פוטונים. לחלופין, צלמו את כלי הדם באמצעות מצלמה המותקנת במיקרוסקופ או באמצעות מצלמה ידנית או טלפון.
   הערה: התמונות והתמונות המצוירות ביד נועדו להקל על ביקור חוזר באותם אזורים רחבים תחת המיקרוסקופ לפני הדמיית שני פוטונים. אלה לא מיפוי תמונות מדויק.
4. תחת הדמיית שני פוטונים, אסוף תמונות של תאים וכלי דם פלואורסצנטיים לפי הצורך. רשום הערות זהירות עם קואורדינטות מתאימות כדי להבטיח שניתן יהיה לבקר מחדש את האזורים המדויקים להדמיה הבאה. אסוף מספר שדות ראייה בפגישת הדמיה ראשונית זו, למשל רכוש תמונות z-stack כל 1-2 מיקרומטר דרך נפח רקמה.
   הערה: בזמן איסוף תמונות על ידי שני פוטונים, ציוני הדרך של כלי הדם משמשים למיפוי גס. אם יש צורך במיפוי עדין, נעשה שימוש בדנדריטים עם תווית YFP מעכברי Thy1-YFP.
   1. השתמש בפרמטרים המומלצים הבאים להדמיה: אורך גל של 880-900 ננומטר הוא אופטימלי; עבור עירור GFP ו/או dsRed / Rhodamine, נעשה שימוש במראה דיכרואית של 565 ננומטר עם מסנני פליטה של 525/50 ננומטר (ערוץ ירוק) ו-620/60 ננומטר (ערוץ אדום); עבור הפרדת GFP ו-YFP, נעשה שימוש במראה דיכרואית של 509 ננומטר עם מסנני פליטה של 500/15 ו-537/26 ננומטר; ההספק במוח נשמר על 25 mW ומטה; רזולוציית התמונה היא 1024 x 1024 פיקסלים, שדה הראייה שצולם עם אובייקט NA 25X 0.9 במקדם זום של 1.5X הוא 295.24 x 295.24 מיקרומטר.
5. בסיום ההדמיה, הורידו את העכבר מהבמה, אפשרו לו להתעורר מההרדמה ולחזור לכלוב הביתי שלו עד לסשן הדמיה עתידי.

5. הדמיה דו-פוטונית והדמיה חוזרת

1. עבור מפגשי הדמיה עתידיים, שיכולים להימשך בין כמה שעות לחודשים לאחר סשן ההדמיה הראשוני, יש להרדים את העכבר (איזופלורן, 5% אינדוקציה ו-1.5% תחזוקה), להרכיב על המיקרוסקופ הדו-פוטוני, לתחזק על צלחת חימום ולהזריק מחדש 100 מיקרוליטר צבע כלי דם כגון רודמין B (2 מ"ג/מ"ל).
2. פתח את התמונות שהושגו בעבר ב-ImageJ, ובאמצעות תמונות אלה כמו גם ההערות מהמפגש הקודם, זהה את האזורים שצולמו בעבר ודמיין אותם מחדש בזהירות.
3. חזור על פעולה זו כל עוד חלון ההדמיה ברור או חיוני להיקף המחקר.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Coverglass (3mm)	Warner Instruments	64-0726
דבק ציאנואקרילט (Krazy Glue)	Amazon	https://www.amazon.com/Krazy-Glue-Original-Purpose-Instant/dp/B07GSF31WZ/ref=sr_1_2?keywords=krazy+glue&qid=1583856837&s=pet-supplies&sr=8-2
Demi Ultra LED Curing Light System	Dental Health Products, Inc	910860-1
Dental Drill	Osada: www.osadausa.edu	EXL-M40
Drill Bit	Fine Science Tools	#19008-07
Eye Ointment	Henry Schien	1338333
iBond Total Etch (Primer Glue)	Chase Dental Supply (Heraeus Kulzer)	66040094
Rhodamine B	Millipore Sigma	81-88-9 (R6626)
דבק Tetris Evoflow (דבק סופי)<	#595956
Wahl Brav Mini+	Amazon	https://www.amazon.com/Wahl-Professional-Animal-BravMini-41590-0438/dp/B00IN24ILE/ref=asc_df_B00IN24ILE/?tag=hyprod-20&linkCode=df0&hvadid=167141013968&hvpos=&hvnetw=g&hvrand=12368793083893626704&hvpone=&hvptwo=&hvqmt=&hvdev=c&hvdvcmdl=&hvlocint=&hvlocphy=9008337&hvtargid=pla-332197544154&psc=1

td style='width:239pt;'>שקע עליון (Ivoclar Vivadent)