הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקת סידן בצמתים עצביים-שריריים בסרעפת של עכבר טרנסגני

תקציר

מקור: } Heredia, D. J., et. al. הדמיה ex vivo של איתות סידן ספציפי לתא בסינפסה המשולשת של דיאפרגמת העכבר. J. Vis. exp. (2018)
}

} סרטון זה מדגים הדמיה פלואורסצנטית של דינמיקת סידן בצמתים עצביים-שריריים (NMJs) בעכבר טרנסגני המבטא מדדי סידן מקודדים גנטית. NJM מזוהה על ידי קולטני אצטילכולין מתויגים פלואורסצנטית בסרעפת עם העצב הפרני. מפצל תמונה משמש להמחשת אותות מרובים בו זמנית. גירוי חשמלי מועבר, ונרשם השינוי בקרינה ב-NMJ בתגובה לזרם הסידן.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. הכנת הסרעפות והעצבים הפרניים מעכברים טרנסגניים

1. רכשו עכברים טרנסגניים ופריימרים אוליגונוקלאוטידים כדי לגנוטיפ את העכברים הללו.
   1. גדל עכבר בן 3 עד 6 חודשים המבטא עותק אחד של האלל הטרנסגני/דפוק המתאים ואפס עותקים של האלל המותנה GCaMP3/6 עם עכבר שני באותו גיל המבטא עותק אחד או שניים של האלל המותנה GCaMP3/6 ואפס עותקים של האלל Cre-driver.
   2. גנוטיפ את הגורים וסמן את אלה עם אללים של Cre ו-GCaMP3/6 מותנה - אלה ייקראו מעתה ואילך עכברים טרנסגניים כפולים (למשל, Myf5-Cre, GCaMP3 מותנה).
      הערה: בדרך זו, כל הנתונים יגיעו מעכברים המבטאים עותק אחד של אללי Cre ו-GCaMP3/6 מותנים. זה חשוב במיוחד כאשר מוסיפים עכברים מוטנטיים אחרים (למשל, נוקאאוטים) להצלבות האלה.
2. כאשר העכברים הטרנסגניים הכפולים הם בגיל המתאים (למשל, יום 0 או 5 לאחר הלידה [P0 או P5] או מבוגרים), המתת חסד של העכברים על ידי עריפת ראשיהם במספריים (עבור עכברים מתחת ל-P10) או על ידי הנחתם בתא אינהלציה איזופלורן. כאשר הם כבר לא מגיבים לצבוט את הזנב עם זוג מלקחיים, הם מוכנים להקרבה.
3. הקריבו את החיה על ידי עריפת ראש בעזרת מספריים.
4. חתך רוחבי על פני כל החיה ממש מתחת לכבד וממש מעל הלב והריאות עם מספריים לכריתת אירית.
5. נתח את הכבד, הלב והריאות, והקפיד לשמור על אורך של העצב הפרני ארוך מספיק כדי להימשך לאלקטרודה יניקה (כלומר, 1 - 2 ס"מ).
   הערה: ניתן לזהות את העצב הפרני השמאלי כפיסת רקמה לבנה הנכנסת לחלק המדיאלי של הסרעפת השמאלית. אסור לחתוך אותו בעת הסרת הריאות. העצב הפרני הימני עובר בתוך פיסת פאשיה המכילה גם את הווריד הנבוב העליון והוא דק ולבן יותר מהווריד הנבוב. יחד, שניהם חודרים לסרעפת המדיאלית הימנית.
6. הסר עוד יותר את כלוב הצלעות ואת עמוד השדרה למעט הרכס הדק סביב הסרעפת.
7. הנח את הדיאפרגמה ואת דגימת העצב הפרני בצינור מיקרופוגה עם תמיסת קרבס-רינגר עם 1 מיקרוגרם/מ"ל 594-αBTX למשך 10 דקות בחושך.
   הערה: ריכוז זה של 594-αBTX מסמן קולטני אצטילכולין (AChRs) מבלי לחסום את תפקודם (תצפית אישית).

2. גירוי ורישום של פוטנציאל פעולת השרירים

1. באמצעות סיכות זעירות, קבעו את הסרעפת על ידי הצמדתה על צלחת בגודל 6 ס"מ המצופה בג'ל סיליקון דיאלקטרי וממולאת ב~8 מ"ל של תמיסת קרבס-רינגר מחומצנת והנח אותה על שלב המיקרוסקופ. החדירו את הדיאפרגמה עם תמיסת קרבס-רינגר נוספת (8 מ"ל/דקה) למשך 30 דקות.
   הערה: זה שוטף את ה-594-αBTX הלא קשור, כמו גם מאזן את הרקמה לאחר הדיסקציה.
2. הכינו אלקטרודת יניקה על פי השיטות שנקבעו.
   1. בהגדלה פי 4, באמצעות מיקרומניפולטור, העבירו את אלקטרודת היניקה מעל העצב הפרני השמאלי והפעילו יניקה על ידי משיכת הקנה של מזרק 5 מ"ל המחובר לצינור המחובר לאלקטרודת היניקה.
      הערה: כאשר נשאבים בהצלחה לתוך אלקטרודת היניקה, העצב הפרני מתוח. הפעל את הממריץ וגרה את העצב הפרני על ידי סיבוב המתג הידני 1x.
   2. ודא שהסרעפת מתכווצת בתגובה לגירוי 1 הרץ על ידי בחינה ויזואלית שלה עם תאורת שדה בהיר. אם לא, כוונן את המתח על ידי סיבוב כפתור המתח באופן הדרגתי כדי להשיג דופק על-מקסימלי, אותו ניתן לאמת על ידי בדיקה ויזואלית של התכווצות השרירים. אם עדיין לא נראה, פוצצו את העצב בעזרת המזרק ונסו למשוך אותו שוב על ידי הפעלת יניקה.
3. כבה את הזלוף והוסף את מעכב המיוזין הספציפי לשריר BHC6 או את אנטגוניסט תעלת הנתרן מגודר המתח μ-conotoxin8 לריכוז סופי של 100 מיקרומטר.
   1. כדי ליצור 100 מיקרומטר BHC, פיפטה 4 מיקרוליטר של מלאי 200 מ"מ ב-DMSO ולדלל אותה מראש ב-1 מ"ל של תמיסת קרבס-רינגר.
   2. מוציאים 1 מ"ל תמיסת קרבס-רינגר מהצלחת.
   3. מוסיפים את ה- BHC המדולל מראש, לתבשיל.
      הערה: דילול זה מסייע במניעת אינדוקציה על ידי DMSO לא מדולל של תגובה פלואורסצנטית לא חולפת בתאים המבטאים GCaMP3.
   4. המתן 30 דקות ולאחר מכן, הפעל את הזלוף של תמיסת קרבס-רינגר טרייה למשך 20 - 30 דקות נוספות.
4. הכן את אלקטרודת ההקלטה.
   1. ללבוש כפפות, הנח זכוכית חוטית בורוסיליקט בקוטר חיצוני (OD) של 1 מ"מ וקוטר פנימי (ID) של 0.4 מ"מ לתוך מושך מיקרופיפטה, הדק את החוגות כדי להדק אותה למקומה, וסגור את דלת המושך.
   2. באמצעות חולץ P-97, תכנת את ההגדרות הבאות: חום ב-900, משיכה ב-120, מהירות ב-75, זמן ב-250, לחץ ב-500 וללא לולאות נוספות.
      הערה: התנגדות (R) נמדדת באמצעות בקרות תוכנה של המגבר: תוכנת רכישת הנתונים מאשרת התנגדות על ידי פתרון הנוסחה V = IR. בקר התוכנה מעביר זרם ידוע (I) (בדרך כלל 1 nA) דרך האלקטרודה ומודד את השינוי במתח (V), ובכך מאפשר לנו לפתור עבור R.
   3. עבור דיאפרגמות עובריות, ודא שההתנגדות קרובה ל-60 MΩ, ועבור דיאפרגמות ישנות יותר, 10 - 20 MΩ. טען את אלקטרודת ההקלטה עם 3 M Posatium chloride (KCl).
5. בהגדלה של פי 10, הורד את האלקטרודה לתוך השריר, באמצעות מיקרומניפולטור שני בצד הנגדי של הבמה כאלקטרודה מגרה.
6. באמצעות תוכנת רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים, המתן עד שפוטנציאל הממברנה במנוחה ישתנה מ-0 ל-65 mV ומטה.
7. לעורר ב-1 הרץ ולוודא את נוכחותו של פוטנציאל פעולת שריר על ידי בדיקת פוטנציאל גדול המציג חריגה צנועה (פוטנציאל שעולה מעל 0 mV כאשר הוא מתחיל ב-65 mV ומטה). אל תבלבל בין חפץ גירוי לבין פוטנציאל פעולה.
   הערה: משך הפוטנציאלים ארוך משמעותית (~5 אלפיות השנייה) מאשר חפצי גירוי.

3. הדמיה של הקרינה של הדגימה

1. }בהגדלה של פי 20, אתר את רצועת לוחית הקצה במרכז השריר על ידי חיפוש צמתים עצביים-שריריים או NMJs עם תווית 594-αBTX תחת עירור אור ירוק/צהוב (550 ננומטר). עברו לעירור האור הכחול (470 ננומטר) לתמונה Ca²⁺{{}} בתאי שריר, נוירון מוטורי או תאי שוואן.
2. אם תרצה, הגדר את מפצל התמונה עם מסנני פס פס ומסנן קצה יחיד דיכרואי להדמיה באורך גל כפול.
3. כדי לחשב את הקרינה המקסימלית (Fmax) המוצגת על ידי רקמה המבטאת GCaMP3/6, הוסף 12 מיקרוליטר של 3 M אשלגן כלורי (KCl) לתכשירי הסרעפת.
   1. בצע ניסויים עם סרגל הבהירות בסרגל טבלת החיפוש המוגדר ל-110% מהרמה שבה הרקמה המבטאת GCaMP3/6 מציגה רוויה בהגדלה של פי 20 ללא שילוב בתגובה ל-KCl.
4. הקלט ב-20 פריימים לשנייה כדי לא לפספס אירועים מהירים.
5. לעורר עם 1 - 45 שניות של 20 - 40 הרץ של גירוי עצבי על ידי העברת רכבת של דחפים באמצעות אלקטרודת היניקה או להוסיף אגוניסטים פרמקולוגיים על ידי מריחת אמבטיה או על ידי זלוף ולאסוף Ca פלואורסצנטי דינמי²⁺ בתת-סוג תא אחד יחד עם האות הסטטי 594-αBTX NMJ.
   הערה: אם עכברי סידן מקודדים גנטית (GECI) או מחווני מתח מקודדים גנטית (GEVI) יהיו זמינים לשימוש ב-NMJ, ניתן להשתמש בהם כדי לאסוף שני אותות דינמיים המשקפים שני אלמנטים תאיים נפרדים ב-NMJ.
6. כאשר ההדמיה או הניסויים האלקטרופיזיולוגיים מסתיימים מכיוון שהתוצאות הרצויות הושגו, יש להחדיר מים דרך קווי הזלוף ולמצוץ מים פי 2 - 3 דרך אלקטרודת היניקה כדי להבטיח שהמלחים לא יצטברו.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Myf5-Cre mice	Jax	#007893	כוננים ביטוי תאי שריר כבר ב-E136
Wnt1-Cre mice	Jax	#003829	מניע ביטוי לכל תאי שוואן ב-E13 אך לא ל-P209
Sox10-Cre mice	Jax	#025807	מניע ביטוי תא שוואן בגילאים מבוגרים יותר
עכברי GCaMP3 מותנים<	#029043	מבטא GCaMP3 באופן ספציפי לתא
Conditional GCaMP6f mice	Jax	#024105	מבטא GCaMP6f באופן ספציפי לתא
BHC (3-(N-butylethanimidoyl)-4-hydroxy-2H-chromen-2-one)	Hit2Lead	#5102862	חוסם מיוזין של שרירי השלד אך לא העברה עצבית6
CF594-α-BTX	Biotium	#00007	Labels אשכולות קולטני אצטילכולין ב-NMJ
μ-conotoxin GIIIb	Peptides Int'l	#CONO20-01000	Blocks Nav1.4 תלויי מתח נתרן channel8
ג'ל דיאלקטרי סיליקון; aka Sylgard	Ellswoth Adhesives	# Sil Dielec Gel .9KG	מאפשר קיבוע של הדיאפרגמה על ידי סיכות זעירות
minutien pins (קוטר 0.1 מ"מ)	Fine Science Tools	26002-10	משתק דיאפרגמה על ג'ל סיליקון דיאלקטרי
Eclipse FN1 מיקרוסקופ זקוף	Nikon	MBA74100	מאפשר בימוי והתבוננות בדגימה
פלטפורמת מיקרוסקופ בסיסית קבועה עם מתרגם מיקרוסקופ XY ידני	Autom8	MXMScr	מאפשר תנועה של דגימה
מיקרומניפולטור ידני	Narishige	M-152	מחזיק הקלטה וגירוי אלקטרודות
מגבר מיקרו-אלקטרודה	Molecular Devices	Axoclamp 900A	מאפשר הקלטה אלקטרופיזיולוגית תוך-תאית חדה
מערכת רכישת נתונים עם רעש נמוך במיקרו-אלקטרודה	התקנים מולקולריים	Digidata 1550	מאפשר רכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים
מערכת ניתוח נתונים של מיקרו-אלקטרודות	התקנים מולקולריים	PCLAMP 10 Standard	מבצע ניתוח נתונים אלקטרופיזיולוגיים
ממריץ גל מרובע	דשא	S48	מעורר עצב לעורר שריר
Stimulus Isolation Unit	Grass	PSIU6	מפחית את חפצי הגירוי
חוטי בורוסיליקט, קוטר חיצוני של 1.0 מ"מ, קוטר פנימי של 0.5 מ"מ	Sutter	FG-GBF100-50-15<
חוטי בורוסיליקט, קוטר חיצוני של 1.5 מ"מ, קוטר פנימי של 1.17 מ"מ<	BF150-117-15	מוארך ומשמש לאלקטרודה יניקה
מושך מיקרופיפטה	Sutter	P-97	מושך ו מכין אלקטרודות הקלטה
1200x1200 pixel, מצלמת cMOS עם תאורה אחורית<	Prime 95b	מצלמה רגישה המאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ובמהירות גבוהה
Light Source	Lumencor	Spectra X	מספק תאורה מנורות LED למניעת פלואורסצנטיות
יעדי טבילה במים פלואורסצנטיים מתוקנים באינסוף, W.D. 2 מ"מ	Nikon	CFI60	ספק מרחקי עבודה ארוכים להדמיה של דגימה
Fiber Optic Illuminator with Halogen lamp	Sumita	LS-DWL-N	מספק תאורה לתצפית שדה בהיר
w-view Gemini Image Splitter	Hamamatsu	A12801-01	מקרין זוג אחד של תמונות באורך גל כפול המופרדות על ידי מצלמה דיכרואית למצלמה בודדת
מסנני פס פס יחיד (512/25-25 ו-630/92-25)	SemRock	FF01-512/ 25-25; FF01-630/92-25	מאפשר הדמיה כפולה
560 ננומטר מפצל קרן דיכרואי חד-קצה	Sem Rock	FF560-FDi01-25x36	מראה דיכרואית המפרידה בין אלומות אור כדי לאפשר הדמיה באורך גל כפול
מערכת רכישת נתוני הדמיה	Nikon	NIS Elements - MQS31000	מאפשר רכישת נתוני הדמיה
מודול בקרת אורך גל	ניקון	MQS41220	מודול עבור נתוני הדמיה Acqusiition
Emission splitter hardware module	Nikon	MQS41410	מודול לרכישת נתוני הדמיה
מערכת ניתוח נתוני הדמיה	NA	Volumetry 8D5, Fiji	מאפשר ניתוח של עוצמת הקרינה ונתוני הדמיה אחרים

td style='background-color:#ffffff; צבע:#1a202c; משפחת גופן:Roboto; גודל גופן: 7 נק'; משקל גופן:רגיל; גלישה:מוסתר; ריפוד: 0 פיקסלים 3 פיקסלים; יישור אנכי:תחתון; רווח לבן:רגיל; גלישת מילים:מילה שוברת; אסטרטגיית עטיפה:4;' >Jaxtd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>impalas ומתעד פוטנציאל שרירים מעורר עצביםtd style='צבע רקע:#ffffff;צבע:#1a202c;משפחת גופנים:רובוטו;גודל גופן:7pt;משקל גופן:רגיל;גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;רווח לבן:רגיל;גלישת מילים:שבירת מילה;אסטרטגיית גלישה:4;'>Suttertd style='background-color:#ffffff; צבע:#1a202c; משפחת גופן:Roboto; גודל גופן: 7 נק'; משקל גופן:רגיל; גלישה:מוסתר; ריפוד: 0 פיקסלים 3 פיקסלים; יישור אנכי:תחתון; רווח לבן:רגיל; גלישת מילים:מילה שוברת; אסטרטגיית עטיפה:4;' >Photometrics