הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים של רקמת מוח של עכבר

תקציר

מקור: Espinoza, R., et al. הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים בזמן אמת של מוח עכבר לצורך אבחון רקמות. J. Vis. exp. (2022).

הסרטון מדגים הדמיית פיזור רמאן מגורה בשני צבעים (SRS) של מקטעי רקמת מוח של עכבר. שתי קרני לייזר מסונכרנות מכוונות אל קטע הרקמה כדי לעורר תנודות מולקולריות, וכתוצאה מכך שינוי עוצמה יחסי בקרניים. שומנים וחלבונים ברקמה מתגלים באמצעות זוגות תדרים מובחנים של קרני הלייזר. לאחר מכן מוקצים לאותות המתקבלים צבעים נפרדים, ויוצרים תמונה דו-צבעונית המסייעת בזיהוי החלבונים והשומנים ברקמה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. זיהוי אותות SRS

1. }אפנון אלקטרואופטי (EOM)
   } הערה: EOM של 20 מגה-הרץ משמש לווסת את משרעת סטוקס. כפי שנדון בהמשך, ה-EOM נגזר מרכבת דופק הלייזר של 80 מגה-הרץ, הנדרשת לאפנון אורתוגונלי. ניתן להשתמש בתדרי אפנון אחרים אם מבוצע רק SRS בצבע יחיד או היפרספקטרלי. במקרה כזה, סנכרון תדר האפנון לתדר הלייזר מיותר. ניתן להשתמש במחולל תדרים עם מגבר הספק בתדר רדיו (RF) כדי להניע EOM. כתוצאה מכך ניתן לדלג על שלבים 1.1.1-1.1.4.
   1. מקם דוגם אלומה בנתיב האלומה של סטוקס כדי לקלוט 10% מהאלומה ושלח אותו לפוטו-דיודה מהירה כדי לזהות את רכבת הפולסים של 80 מגה-הרץ.
      הערה: אות הפוטו-דיודה נשלח למחלק תדרים כדי ליצור פלט TTL של 20 מגה-הרץ. יציאה זו נשלחת עוד יותר למאגר מאוורר כדי לשכפל את הפלט לארבע יציאות זהות של 20 מגה-הרץ. אחת היציאות משמשת להפעלת האוסילוסקופ.
   2. קח את אחת היציאות של מאגר ה-fanout וסנן אותה עם מסנן פס-פס כדי לקבל גל סינוסואידלי של 20 מגה-הרץ. השתמש במנחת RF כדי לכוונן את מתח השיא לשיא המוצא ל-~500 mV.
   3. שלח את הפלט המתקבל למעביר פאזה, המאפשר התאמה עדינה של שלב ה- RF עם מקור מתח. שלח את הפלט הזה למגבר הספק RF וחבר את הפלט של המגבר ל-EOM.
   4. שחרר את חסימת אלומת Stokes ומטב את עומק האפנון של EOM1 על ידי הצבת פוטו-דיודה בנתיב האלומה. כוונן את נפח ה-EOMTAGE ולוחית רבע הגל עד שעומק האפנון (יחס העמק לשיא) נראה משביע רצון.
      הערה: באפנון של 20 מגה-הרץ (1/4 מקצב חזרת הלייזר), צפויים שני פולסים כל 50 ns.
2. חפיפה זמנית
   הערה: חפיפה זמנית של המשאבה וסטוקס מושגת על ידי עיכוב אחת משתי רכבות פולס הלייזר עם רפלקטור המותקן על שלב ההשהיה (איור 1} מראה את הסטוקס מתעכב). חפיפה גסה מנוטרת באמצעות האוסילוסקופ, וחפיפה עדינה מנוטרת על ידי אות ה-SRS. ניתן להשיג חפיפה זמנית עדינה גם עם מתאם אוטומטי אם זמין.
   1. הנח פוטודיודה אחרי המראה הדיכרואית כדי לזהות את קרן הלייזר. חסום את קרן סטוקס תחילה. התקרב לאחת מפסגות הדופק של המשאבה באוסילוסקופ. מקם סמן אנכי כדי לסמן את המיקום הזמני של פסגה זו עם האוסילוסקופ.
   2. חסום את קרן המשאבה ובטל את החסימה של קרן סטוקס. תרגם את שלב ההשהיה כך שיתאים זמנית למיקום השיא באוסילוסקופ למיקום המסומן בשלב הקודם. ראה }איור 2 להצגת החפיפה הזמנית של שתי אלומות.
      1. (אופציונלי) אם התרגום של שלב ההשהיה אינו מספיק כדי להתאים זמנית את שתי הקורות, העבר את שלב ההשהיה לאמצע טווח התנועה שלו.
      2. חשב את מרחק ההשהיה הנדרש כדי להתאים את שתי הקרניים על ידי לקיחת הפרש הזמן בין שתי הקרניים והכפלת ההפרש במהירות האור כדי למצוא את כמות המרחק הדרושה כדי להתאים את שתי הקרניים באופן זמני.
      3. האריך את נתיב האלומה של האלומה המהירה יותר או קצר את נתיב האלומה של האלומה האיטית יותר כך שיתאים בערך לעיכוב הזמני בהתאם.
   3. הכן דגימת שקופיות מיקרוסקופ עם דימתיל סולפוקסיד (DMSO) וסרט דו צדדי כמרווח כדי להחזיק את הדגימה בין השקופית לכיסוי.
   4. הנח את הדגימה על המיקרוסקופ כשצד הכיסוי פונה למטרת המיקרוסקופ. שנה את המיקרוסקופ לתאורת שדה בהיר והתבונן בדגימה מהעינית. מצא את המוקד של הדגימה על ידי מציאת המוקד בשכבה העליונה והתחתונה של בועות האוויר בממשק סרט הזכוכית, ולאחר מכן הזז את המוקד כך שיהיה בין שתי שכבות הסרט.
      הערה: ודא שקרני הלייזר חסומות לפני שאתה מסתכל לתוך העינית.
   5. הגדר את תפוקת האלומה המתכווננת ל-798 ננומטר. בהתבסס על התפוקה האופטית של הקבל, כוונן את ההספק האופטי כך שיהיה ~40 mW כל אחד עבור המשאבה וקרני סטוקס במוקד האובייקטיבי.
   6. פתחו את ScanImage ב-MATLAB (או בתוכנת סריקה אחרת ששולטת במיקרוסקופ) ולחצו על הכפתור שכותרתו } פוקוס כדי להתחיל בסריקה.
      הערה: קרני הלייזר ייסרקו ברסטר דרך הדגימה כדי ליצור תמונה. יציאת האות בתדר נמוך מהפוטו-דיודה (<100 kHz) נשלחת ישירות לערוץ 1 של כרטיס קליטת הנתונים (המכונה ערוץ DC). היציאה בתדר גבוה (>100 kHz) מהפוטו-דיודה נשלחת לתוך מגבר הנעילה, ויציאת ה-X של אות מגבר הנעילה נשלחת לערוץ 2 של כרטיס קליטת הנתונים (המכונה ערוץ AC).
   7. כוונן את מראת ההיגוי לפני סורק ה-galvo כדי למרכז את אות ה-DC בתצוגת ערוץ 1. הזז את ההשהיה הממונעת tagה והתבונן מקרוב בפלט הנעילה המוצג בתצוגת ערוץ 2 (כלומר, ערוץ AC).
      הערה: כאשר המשאבה וסטוקס חופפים בזמן, יופיע אות בערוץ AC. כדאי להתאים את סולם הצבעים של ערוץ AC כדי להציג את שינוי העוצמה הקטן.
   8. מקסם את עוצמת אות ה-AC על ידי כוונון עדין של עיכוב הזמן. כוונן את המראה הדיכרואית כדי למרכז את אות ה-SRS בערוץ ה-AC (תוך שמירה על ערוץ ה-DC במרכז). כוונן את הפאזה של מגבר הנעילה כדי למקסם את האות. ראה } איור 3 לאות משביע רצון.

3. אופטימיזציה של רזולוציה ספקטרלית

} הערה: המשאבה ואלומות סטוקס המגיעות לדגימה צריכות להיות באותה כמות של פיזור עיכוב קבוצתי (GDD) כדי למקסם את הרזולוציה הספקטרלית. הפיזור תלוי במידה רבה במערך הניסוי. המערך הניסיוני המתואר כאן משתמש בפולסים של פמטו-שניות ב-1,040 ננומטר ו-800 ננומטר כסטוקס ומשאבה, בהתאמה. מוטות זכוכית צור צפופים (H-ZF52A) משמשים כמדיום מתיחת הדופק.

1. הכנס 48 ס"מ של מוט זכוכית מפזר מאוד (H-ZF52A או זכוכית צור צפופה שווה ערך) לנתיב האלומה של 800 ננומטר. הערך את ה-GDD באמצעות Eq (1):

   

   } הערה: ניתן למצוא GVD של חומרי זכוכית שונים באורכי גל שונים ממשאב מסד הנתונים של אינדקס השבירה. לדוגמה, ל-H-ZF52A יש GVD של 220.40 fs²/מ"מ ב-800 ננומטר. סך הכל GDD הוא 105792 fs².

2. חשב כמה ס"מ של מוט הזכוכית המפזר נדרש כדי להוסיף לנתיב האלומה של 1,040 ננומטר כדי להתאים ל-GDD של המשאבה. הכנס את האורך המתאים של מוטות זכוכית מפזרים לנתיב האלומה של 1,040 ננומטר כדי להתאים בערך ל-GDD של אלומת 800 ננומטר. שימו לב שתוספת של מוטות זכוכית תשנה את החפיפה הזמנית של שתי הקורות, וייתכן שיהיה צורך בהתאמת העיכוב.
3. כיול הרזולוציה הספקטרלית
   1. צור דוגמת שקופית מיקרוסקופ עם DMSO. הנח את השקופית על המיקרוסקופ ובדוק את עוצמת הקורות היוצאות ממעבה המיקרוסקופ. כוונן את ההספק בהתאם כך שיהיה ~40 mW כל אחד במוקד הדגימה.
   2. פתח את }ScanImage מ-MATLAB. מצא את אות ה-SRS המקסימלי על ידי סריקה דרך שלב ההשהיה, המתאים ל-2,913 ס"מ^-1 שיא רמאן של DMSO. הערך את מיקום הבמה על סמך מיקום השלב הקודם עם אורך הנתיב האופטי המוגדל עקב הכנסת מוטות. יישר מחדש את החפיפה המרחבית של הקורה בגלל הסטייה הקטנה של הקורה בעת הוספת מוטות זכוכית.
   3. שמור סריקת SRS היפר-ספקטרלית על-ידי צילום סדרה של תמונות SRS ברצף תוך כדי הזזת הבמה הממונעת.
      הערה: טווח סריקת ההשהיה מכסה שתי פסגות ראמאן, המתאימות ל-2,913 ס"מ^-1 ו-2,994 ס"מ^-1{{}} פסגות ראמאן של DMSO, בהתאמה. שני המעברים הללו נצפים בעת שימוש במשאבה של 800 ננומטר ובלייזר סטוקס של 1,040 ננומטר.
   4. שרטט את ספקטרום ה-SRS של פתרון ה-DMSO באמצעות ImageJ או MATLAB. התאם את השיא הגדול של DMSO 2,913 ס"מ^-1 לפונקציה גאוס או לורנציאנית ב-MATLAB כדי לחשב את הרוחב המלא בחצי המקסימום (FWHM) של השיא.
      הערה: תוצאות מייצגות מוצגות ב}איור 4. אם קיימת רק שיא רחב אחד, פירוש הדבר שהרזולוציה הספקטרלית גרועה מכדי להבחין בין שתי הפסגות ונדרשים מוטות זכוכית נוספים, או שהטווח הסרוק היה קטן מכדי לזהות את השיא השני. בדרך כלל, DMSO ברזולוציה ספקטרלית מקובלת היא ~20-25 ס"מ^-1} כאשר משתמשים במוט זכוכית באורך >60 ס"מ. רזולוציה נמוכה יותר משמשת לעתים קרובות להדמיית רקמות כדי להחליף אותות גבוהים יותר עם פולסים קצרים יותר.
4. (אופציונלי) השתמש במתאם אוטומטי או ב-FROG (Frequency-Resolved Optical Gating) כדי לקבוע את משך הדופק של כל זרוע כדי לחשב בדיוק את כמות ה-GDD ואת אורך המוטות הדרושים כדי להתאים את ה-GDD בין המשאבה לסטוקס.
5. חזור על שלבים 3.3.2-3.3.4 עבור אורכי מוטות שונים על קרן סטוקס כדי למצוא את הרזולוציה הספקטרלית האופטימלית, מה שאומר שהתאמת ה-GDD הטובה ביותר נמצאה בניסוי. השתמש במספר סטים של מוטות זכוכית באורך שונה כדי להשיג רזולוציה ספקטרלית אופטימלית.

4. אפיון אות לרעש (SNR)

1. ודא ששלב 4.2 מבוצע לאחר יישור מרחבי וזמני מלא.
2. רכוש תמונת SRS המתאימה לפסגת ה-2,913 ס"מ^-1{{}} פסגת ראמאן של DMSO. פתח את התמונה ב- ImageJ ובחר אזור קטן במרכז המסגרת. השתמש בפונקציה למדוד כדי לחשב את הממוצע וסטיית התקן של ערכים באזור שנבחר.

3. חלקו את הערך הממוצע של האזור שנבחר בסטיית התקן כדי למצוא את ערך ה-SNR, כמו ב-Eq (2).

   

   הערה: SNR טוב למערכת (עם קבוע זמן נעילה של 4 מיקרון) המשתמש ב-DMSO ב-40 mw/40 mw בפוקוס עבור שתי הזרועות הוא >800. ניתן להשתמש בריכוזים נמוכים יותר של DMSO או בהספק נמוך יותר להערכה מדויקת יותר של ה-SNR אם לכרטיס רכישת הנתונים יש עומק סיביות מוגבל.

4. אם ה-SNR נמוך מדי, יישר מחדש את פולסי הלייזר כדי לייעל את החפיפה המרחבית, החפיפה הזמנית, התאמת גודל הקרן/קולימציה ו/או התאמת פיזור. למטרה עם צווארון לתיקון סטייה, בצע אופטימיזציה של האות על ידי התאמת צווארון התיקון.

5. כיול ציר התדרים

} הערה: שלב זה מבוצע כדי לקשר את מיקום שלב ההשהיה למעבר ראמאן הסרוק. נדרשת בחירה קפדנית של ממיסים כדי ליצור "שליט ראמאן" מתאים. DMSO הוא ממס יעיל עבור קשרי CH מכיוון שיש לו שתי פסגות ראמאן חדות ב-2,913 ס"מ^-1 ו-2,994 ס"מ^-1.

1. שמור סריקה היפרספקטרלית עם טווח שלב ההשהיה המכסה את 2,913 ס"מ^-1 ו-2,994 ס"מ^-1 פסגות ראמאן של DMSO. שמור את מיקומי הבמה המתאימים למערך הנתונים ההיפרספקטרלי.
   הערה: השיא המקסימלי הגלובלי של הספקטרום מתאים ל-DMSO 2,913 ס"מ^-1 והשיא המקסימלי השני מתאים ל-DMSO 2,994 ס"מ^-1.
2. בצע רגרסיה ליניארית עבור עמדות הבמה והעברות ראמאן ב-2,913 ס"מ^-1 ו-2,994 ס"מ^-1. באמצעות משוואת הרגרסיה הליניארית המתייחסת למיקום הבמה לשינוי הראמאן, המר את מיקומי ההשהיה לתדרי הרמאן המתאימים.

6. אפנון אורתוגונלי והדמיה דו-צבעונית

הערה: שלב האפנון האורתוגונלי נחוץ רק כאשר יש צורך בהדמיה דו-צבעונית בזמן אמת. הסכימה של סכימה זו מוצגת ב איור 5. האפנון האורתוגונלי משתמש בזוג EOMs המונעים ברבע מתדר הלייזר (20 מגה-הרץ עבור לייזר 80 מגה-הרץ) עם הסטת פאזה של 90 מעלות בין השניים. ניתן לדלג על שלב אפנון אורתוגונלי זה עבור הדמיית SRS בצבע יחיד או הדמיית SRS היפרספקטרלית.

1. אפנון EOM1
   1. התקן מפצל אלומה מקטב (PBS2), לוח רבע גל (QWP2) ו-EOM שני (EOM2) בנתיב האלומה של סטוקס לאחר ה-EOM הראשון. נתק את כניסת האות ל-EOM2. חבר את כניסת האות ל-EOM1 והפעל אותה.
   2. לווסת את אלומת סטוקס (קבועה ב-1,040 ננומטר) ב-20 מגה-הרץ (f₀/4) על ידי שליחת האלומה דרך ה-EOM הראשון. כוונן את ההטיה והמיקום של EOM1 כדי להבטיח שהאלומה פוגעת ישר וממורכזת דרך גביש ה-EOM.
   3. עקוב אחר עומק האפנון על ידי התבוננות בשני הקיטובים היוצאים מ-PBS1 עם שתי פוטו-דיודות והצגת האפנון על אוסצילוסקופ.
   4. כוונן את מתח ה-QWP1, EOM1 והפאזה של כניסת 20 מגה-הרץ (באמצעות מעביר פאזה) כדי לייעל את עומק האפנון של האלומה המשודרת כך שיהיה קרוב ל-100%. ראה איור 2B להמחשה של עומק אפנון טוב.
2. אפנון EOM2
   1. נתק את EOM1 וחבר את EOM2.
   2. שלח פנימה את המתח הגבוה של המגבר השני ב-20 מגה-הרץ ל-EOM2. כוונן את ההטיה והמיקום של EOM2 כדי להבטיח שהאלומה פוגעת ישר וממורכז דרך גביש ה-EOM.
   3. שוב, עקוב אחר עומק האפנון על ידי התבוננות בשני הקיטובים היוצאים מ-PBS2 עם אוסצילוסקופ. כוונן את מתח QWP2, EOM2 ומעביר הפאזה לפי הצורך כדי להשיג אפנון קרוב ל-100% עבור שני הקיטובים.
   4. ודא שלאפנון רכבת הדופק יש שינוי פאזה של 90° מהאפנון הראשון.
      הערה: אם שתי רכבות הפולסים של המשאבה אינן אורתוגונליות ב-90°, דיבור צולב בין שני הערוצים יהווה בעיה.
   5. בדוק את האורתוגונליות של האפנון על-ידי הפעלה וחיבור של EOM1 ו-EOM2. עקוב אחר שני הקיטובים המפוצלים על ידי PBS2 עם אוסצילוסקופ. בצע אופטימיזציה מחדש של EOM1 ו-EOM2 בנפרד אם רכבת הדופק לאחר ה-PBS השני אינה דומה ל-איור 2C.
   6. התקן גביש קוורץ דו-שביר (BRC) 20 מ"מ וצלחת חצי גל (HWP) במורד הזרם של EOM2. חבר את שני ה-EOMs בבת אחת ונטר את רכבת הדופק כך שהיא תדמה ל-איור 2D.
      הערה: עבור הציוץ ששימש בניסוי זה, BRC של 20 מ"מ גורם לעיכוב זמן המתאים להזזת רמאן של 80 ס"מ^-1. ייתכן שיהיה צורך באורך BRC שונה אם נעשה שימוש בציוץ אחר.
3. כיול
   1. כייל את המערכת באמצעות DMSO על ידי זיהוי אותות ממגבר הנעילה פלט ערוץ X ו-Y (נשלח לערוצים 2 ו-3 של כרטיס רכישת הנתונים).
   2. בדוק אם האותות שנוצרים על ידי 2,913 ס"מ^-1 מגיעים לשיא מהקיטוב המהיר יותר וזה מהקיטוב האיטי יותר קרובים ל-90 מעלות מחוץ לפאזה במגבר הנעילה. אם זה לא המקרה, כוונן את יישור ה-EOM עד ששני האותות קרובים ל-90° מחוץ לפאזה.
   3. לאחר השלמת הכיול, מצא את מיקום ההשהיה הבודק את מעבר החלבון ב-2,930 ס"מ^-1 עבור אחת מהאלומות האורתוגונליות. ודא שהקיטוב השני בודק את מעבר השומנים של 2,850 ס"מ^-1.

7. הדמיית SRS במצב אפי

} הערה: בסכימת הדמיית מצב שידור, המטרה ממקדת את הלייזר לתוך הדגימה, ואז עדשת מעבה מכוונת את הקרן המשודרת לפוטודיודה לזיהוי נעילה. בסכימת ההדמיה של epi-mode, אור שמפוזר לאחור ומפוזר על ידי הדגימה נאסף מחדש על ידי האובייקט הממוקד ומבודד באמצעות מפצל קרן מקטב. הפוטונים המבודדים והמפוזרים לאחור נשלחים לפוטודיודה דרך זוג עדשות ממסר לזיהוי נעילה. איור 6 מתאר את סכימת ההדמיה במצב אפי.

1. התקן HWP לפני שהקרן נכנסת למיקרוסקופ כדי לשנות את הקיטוב של הקרן הנכנסת למיקרוסקופ. הנח PBS מעל המטרה כדי לאפשר לקרן המשתקפת לאחור המקוטבת להגיע לגלאי.
2. השתמש בזוג עדשות המורכבות מעדשת אכרומט של 75 מ"מ ועדשה אספרית של 30 מ"מ כדי להעביר את הפוטונים המפוזרים לאחור מהצמצם האחורי של האובייקט לגלאי הפוטו. התקן את הגלאי כדי לאסוף את האור המפוזר לאחור המכוון על ידי ה-PBS. התקן מסנן כדי לחסום את כניסת הקרן המאופנת לגלאי.
3. הנח את דגימת הרקמה מתחת למטרה. מכיוון שהמעבה מיותר להדמיה במצב אפי, הסר אותו אם נדרש יותר מקום.
4. הדמיה
   1. לחסום את האלומה עם תריס; להאיר מקור אור לבן על הדגימה מהצד; והשתמש ב-Brightfield כדי למצוא מיקוד אובייקטיבי.
   2. שחרר את חסימת שתי הקורות והשתמש במיקומי ההשהיה המכוילים מראש כדי לרכוש תמונות SRS של שומנים וחלבונים מרקמה משתי היציאות של מגבר הנעילה.
   3. התאם את רווח הנעילה ואת גורם סל הפיקסלים כדי לקבל תמונות באיכות טובה.

8. צביעה בצבע כוזב

1. פתח את ערימת התמונות עם ImageJ.
2. ניתן לשלוף את שתי התמונות התואמות למיני השומנים (2,850 ס"מ^-1) ולחלבון (2,930 ס"מ^-1) על ידי לחיצה ימנית על התמונה ולחיצה על }{{}}}}.
3. שנה את שם תמונת השומנים ל-ליפידים ואת תמונת החלבון ל-{{}}חלבונים.
4. עבור אל תהליך | מחשבון תמונה ובצע {{}}{{}}} ליפידים.
5. שלב את התמונות על ידי מעבר אל תמונה | צבע | מיזוג ערוצים, הגדרת } ליפידים ל- ירוק ו-TAG_916{{}} ל-TAG_922}{{}}. פתח את הכלי ערוצי תמונה (תמונה | צבע | כלי ערוצים) ולהתאים את הבהירות והניגודיות (תמונה | התאם | בהירות/ניגודיות).
6. התאם את הבהירות והניגודיות עבור כל ערוץ באמצעות הכלי ערוצים . עבור תעלת השומנים, התאם את הניגודיות עד שהתכונות הסלולריות ייראו כהות. עבור ערוץ החלבון, התאם את הניגודיות עד שהתכונות התאיות יופיעו כחולות. המר את תמונת הערוץ הממוזג ירוק/כחול לתמונת RGB על ידי מעבר אל תמונה | סוג | צבע RGB. ייצוא תמונה זו על ידי קובץ | שמירה בשם | tiff.
   הערה: עבור צביעה כוזבת של H&E, ערכת הצבעים מציגה ציטופלזמה ורודה, בעוד שהגרעינים הם כחול-סגול כהה.
7. הורד את סקריפט HE.m MATLAB ממשאב סקריפט הצביעה הכוזב של H&E בטבלת החומרים.
8. הפעל את סקריפט HE.m ב-MATLAB. בחר את תמונת ה-RGB המיוצאת מהשלב הקודם כדי ליצור תמונה מוכתמת ב-H&E באופן מלאכותי.
9. (אופציונלי) נרמל את עוצמת התמונה להדמיה של שדה ראייה גדול מכיוון שהתמונה נראית כהה יותר בפריפריה מאשר במרכז.
   1. כדי לבצע נורמליזציה של התמונות בשטח, ממוצע תמונות רבות ככל האפשר. לאחר מכן, הסר את תכונות העוצמה עם ImageJ ( תהליך | מסננים | טשטוש גאוס | רדיוס=50).
   2. מדוד את העוצמה המקסימלית של התמונה המטושטשת (Ctrl+M). חלקו את התמונה המטושטשת בעוצמה המקסימלית (תהליך | מתמטיקה | חלוקה). חלקו את תמונת ה-SRS הגולמית בתמונה המטושטשת (תהליך | תמונה | מחשבון).

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
100 מ"מ עדשה אכרומטית<	AC254-100-B	פס רחב, 650 - 1,050 ננומטר, אורך מוקד עדשה אכרומטית, 100 מ"מ
20 MHz bandpass filter	Minicircuits	BBP-21.4+	Lumped LC Band Pass Filter, 19.2 - 23.6 MHz, 50 Ω
200 מ"מ עדשה אכרומטית<	AC254-200-B	פס רחב, 650 - 1,050 ננומטר, אורך מוקד עדשה אכרומטית, 200 מ"מ
Achromatic Half Waveplate	Union Optic	WPA2210-650-1100-M25.4	Broadband half waveplate
לוח גל רבע אכרומטי<	WPA4210-650-1100-M25.4	לוח גל רבע פס רחב
Beam Sampler	THORLABS	BSN11	10:90 Plate Beamsplitter
מראה דיכרואית	THORLABS	DMSP1000	ניתן להשתמש בדיכרואיקות אחרות עם אורך גל מרכזי בסביבות 1,000 ננומטר.
DMSO (Dimethyl sulfoxide)<	472301	Solvent for calibration of Raman shift. ניתן להשתמש בממיסים אחרים עם פסגות ראמאן ידועות.
Electrooptic Amplitude Modulator	THORLABS	EO-AM-NR-C1	יש צורך בשני EOMs לאפנון אורתוגונלי והדמיה דו-ערוצית. גרסת תהודה מומלצת כך שניתן להשתמש בנפח נהיגה נמוך יותרtage.
False H&E Staining Script	Matlab		https://github.com/TheFuGroup/HE_Staining
Fanout Buffer	PRL-414B	Pulse Research Lab	1:4 TTL/CMOS Fanout Buffer ומנהל התקן קו, ליצירת תדירות הנהיגה של EOM וההתייחסות ל-lock-in
Fast Photodiode	THORLABS	DET10A2	גלאי Si, זמן עלייה של 1 ns
Frequency Divider	PRL-220A	Pulse Research Lab	TTL freq. מפריד (f/2, f/4, f/8, f/16), עבור הפקת 20 מגה-הרץ מפלט הלייזר.
מוטות זכוכית מפוזרים מאוד	Union Optic	CYLROD01	פיזור גבוה H-ZF52A עדשת מוט 120 מ"מ, מוט SF11 עדשה 100 מ"מ
Insight DS+	Newport		מערכת לייזר המסוגלת להוציא שני לייזרים פולסים מסונכרנים (קרן קבועה אחת ב-1,040 ננומטר וקרן אחת ניתנת לכוונון, הנעה בין 680-1,300 ננומטר) עם קצב חזרה של 80 מגה-הרץ.
מגבר נעילה	Liquid Instruments	Moku Lab	Lock-in ampliifier כדי לחלץ אות SRS מהפוטו-דיודה. ניתן להשתמש גם במכשיר ציריך HF2LI או במכשיר דומה.
Mirrors	THORLABS	BB05-E03-10	מראה דיאלקטרית בפס רחב, 750 - 1,100 ננומטר. ניתן להשתמש גם במראות כסף.
Motorized Delay Stage	Zaber	X-DMQ12P-DE52	שלב עיכוב לשליטה עדינה בחפיפה הזמנית של המשאבה והלייזרים של סטוקס. כל שלב ממונע אחר אמור לעבוד.
Oil Immersion Condensesor	Nikon	CSC1003	1.4 NA. ניתן להשתמש במעבים אחרים עם NA>1.2.
Oscilloscope	Tektronix	TDS7054	כל אוסילוסקופ אחר עם bandwdith של 400 מגה-הרץ ומעלה אמור לעבוד.
Phase Shifter	SigaTek	SF50A2	להזזת השלב של תדר האפנון
Photodiode	Hamamatsu Corp	S3994-01	דיודת PIN סיליקון עם שטח גדול (10 x 10 סמ"ר). ניתן להשתמש בדיודות אחרות בעלות שטח גדול וקיבול נמוך.
מפצל אלומה מקטב	Union Optic	PBS9025-620-1000	מפצל אלומה מקטב פס רחב
Refactive Index Database			refractiveindex.info
Retro-reflector	Edmund Optics	34-408	BBAR זווית ישרה פריזמה. ניתן להשתמש במנסרות אחרות או ברטרופלקטור.
מגבר כוח RF	Minicircuits	ZHL-1-2W+	Gain Block, 5 - 500 MHz, 50 Ω
Scan Mirrors	Cambridge Technologies	6215H	השתמשנו בסט מראה של 5 מ"מ עם ציפוי כסף
ScanImage	Vidrio	ScanImage Basic	תוכנת בקרת מיקרוסקופ לסריקת לייזר
Shortpass Filter	THORLABS	FESH1000	25.0 מ"מ מסנן מעבר קצר פרימיום, אורך גל חיתוך: 1,000 ננומטר. לדיכוי יעיל של הסטוקס, ייתכן שיהיה צורך בשני מסננים.
Upright Microscope<	Eclipse FN1	ניתן להשתמש בכל מסגרת מיקרוסקופ אחרת. אם קיים מיקרוסקופ סריקת לייזר, ניתן להשתמש בו ישירות. אחרת, היה צורך להוסיף למיקרוסקופ סורק גלבו ועדשת סריקה.
Water Immersion Objective	Olympus	XLPLN25XWMP2	ל-multiphoton 25X Objective יש NA של 1.05. ניתן להשתמש במטרות דומות אחרות.

td style='גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'>THORLABStd style='גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'>THORLABStd style='גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'>Union Optictd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma Aldrichtd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Nikon