מיקרוסקופיה דו-פוטונית של אסטרוציטים ונוירונים מעוררים ברקמת היפוקמפוס של עכבר מנוקה

תקציר

מקור: }Refaeli, R., et al.}, חקירת אינטראקציה מרחבית בין אסטרוציטים ונוירונים במוח נקי. J. Vis. exp. (2022)
}

}הסרטון מדגים את ההכנה של תא והדמיה מוחית של רקמת היפוקמפוס של עכבר מנוקה באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני כדי להמחיש את האינטראקציות המרחביות בין אסטרוציטים המסומנים פלואורסצנטית ונוירונים מעוררים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. הכנת החדר

הערה: כל דגימה דורשת שקופית עם תא הדמיה שבו תוצב הדגימה.

1. הנח את הדגימה באמצע השקופית.
2. בעזרת אקדח דבק חם, צור קירות בשולי המגלשה, כמעט בגובה הרקמה. הקפידו להשאיר רווח קטן (כ-5 מ"מ) באחת הפינות (איור 1A, B).
3. מרחו 1-2 טיפות של תמיסת התאמת מקדם השבירה או RIMS על הדגימה כדי לשמור על לחות המשטח העליון ולמנוע היווצרות בועות בין הכיסוי לרקמה.
4. מיד לאחר מריחת טיפות ה-RIMS (Refractive Index Matching Solution) יש להוסיף את שכבת הדבק החם האחרונה לדפנות (כך שיגיעו לגובה המוח/פרוסה) ולהתקדם מיד (כשהדבק החם עדיין נוזלי) לשלב 1.5.
5. אטמו את החלק העליון עם כיסוי, והניחו אותו בצורה אחידה ככל האפשר על החלק העליון של שכבת הדבק החם שעדיין חמה (} איור 1C).
6. מלאו את התא עם החישוקים דרך הרווח שנותר בקירות הדבק החם (איור 1D, E).
7. סגור את הפער עם דבק חם. אל תשאיר אוויר בפנים ( איור 1F).
8. אם קירות הדבק החם נמשכים מעבר לגבולות השקופית, חתוך את הקצוות המתארכים ( איור 1G).
9. אם המטרה המשמשת להדמיה שקועה, הוסף עוד 2-3 מ"מ של דבק לקירות שמעל לכיסוי כך שתמיסת הטבילה תחזיק מעמד זמן רב יותר (}איור 1H).

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
AAV1-GFAP::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		וקטור ויראלי המשמש לזיהוי אסטרוציטים
AAV5-CaMKII::eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		וקטור ויראלי המשמש לזיהוי נוירונים
AAV5-CaMKII::H2B-eGFP	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		וקטור ויראלי המשמש לזיהוי גרעינים עצביים
AAV5-CaMKII::TdTomato	ELSC Vector Core Facility (EVCF)		וקטור ויראלי המשמש לזיהוי נוירונים
Imaris software	Bitplane, UK		תוכנה המאפשרת ניתוח תלת-ממדי של תמונות
RapiClear	SunJin lab	#RC147002
RapiClear CS	SunJin lab	#RCCS002
SyGlass software			תוכנה המאפשרת ניתוח תלת-ממדי של תמונות באמצעות מציאות מדומה
שני מיקרוסקופ פוטונים	Neurolabware		Ti:לייזר ספיר (Chameleon Discovery TPC, קוהרנטי), צינורות מכפיל צילום GaAsP (Hamamatsu, H10770-40), מסנן פס פס (Semrock), טבילה במים 16x אובייקט (Nikon, 0.8 NA)
VA-044 Initiator	Wako	#011-19365