מאמר שיטה

הדמיית הסינפטוגנזה של נוירונים גרגירי המוח הקטן בשלבי התפתחות שונים

29 במאי 2025

במאמר זה

תקציר

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

מקור: ChanU., et al., שימוש באלקטרופורציה שלאחר הלידה in vivo כדי לחקור את המורפולוגיה של נוירוני גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסות. J. Vis. Exp. (2021).

סרטון זה מדגים את הניתוח של התפתחות נוירונים של גרגירי המוח הקטן על ידי הדמיית פרוסות רקמת מוח קבועות מראש מעכברים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי, לכידת תמונות z-stack ברזולוציה גבוהה עם מיקרוסקופ קונפוקלי, ומדידת פרמטרים מבניים כולל אורך נויריט, היווצרות טפרים דנדריטיים, שטח פנים ונפח לחקר סינפטוגנזה.

פרוטוקול

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. ניתוחים מורפולוגיים של נוירונים גרגירי מוח קטן או CGNs - שחזור תלת מימדי (תלת מימדי) ושטח פנים ונפח תאי

  1. תמונה של CGNs בודדים אלקטרופוטיים במיקרוסקופ קונפוקלי באובייקט 63x עם זום פי 2, תוך צילום תמונות z-stack ב-0.5 מיקרומטר לכל ערימה. דמיין תא אחד לכל חלון תמונה כדי לאפשר ניתוח ושחזור קל של תמונה.
  2. התקן את התוסף Simple Neurite Tracer עבור פיג'י באמצעות הקישור הבא (https://imagej.net/Simple_Neurite_Tracer:_Basic_Instructions) כדי לעקוב בקלות וביעילות אחר המבנה של CGNs אלקטרופוטיים במרחב תלת מימדי (3D).

הערה: קיימת גרסה מעודכנת של התוסף (https://imagej.net/SNT).

  1. לנתח את אורך הנויריט ואת היווצרות הטפרים הדנדריטיים בצורה עיוורת באמצעות עוקב נויריט פשוט. העלה תמונות z-stack חד-ערוץ של CGNs אלקטרופוטיים ל-FIJI, ולחץ על תוספים | סגמנטציה | עוקב נויריט פשוט (איור 1D).
  2. גש לתפריט הנפתח ובחר צור מציג תלת-ממד חדש ( איור 1D).
  3. גלול לבסיס של דנדריט, שם הוא מתחבר לסומה התא, והתחל נתיב על ידי לחיצה על הצומת. עקוב אחר הנתיב באופן ידני על-ידי לחיצה על המקטעים שבהם אות מילוי התא הוא הבהיר ביותר, תוך לחיצה על [y] כדי לשמור על המעקב. עקוב עד סוף הדנדריט אם הוא אינו מכיל טופר או עד לבסיס הטופר ואשר את הנתיב על ידי לחיצה על [f] ( איור 2D).
  4. לאחר מכן, עקבו אחר הטופר על ידי התחלת נתיב בבסיס המבנה ומעקב עד לסוף הנויריט הארוך ביותר. עקבו אחר ענפים משניים ושלישוניים באמצעות לחיצה ממושכת על [ctrl] ב- Windows או [alt] ב- Mac OS ולחיצה על הנתיב. אשר את הנתיב על-ידי הקשה על [f].
  5. שימו לב שמדידות העקבות נראות בחלון נפרד; חבר את כל המידות של ענפי הטופר (ראשוני, משני, שלישוני) כדי לקבל את האורך הכולל של כל טופר.
  6. לניתוח שטח הפנים והנפח הסלולרי של CGNs אלקטרופורטיים, הורד את תוכנת ניתוח התאים של Imaris (https://imaris.oxinst.com/).

הערה: FIJI יכול לשמש גם לשחזור תאים בתלת-ממד מתמונות z-stack באמצעות תוספים זמינים וחינמיים. בנוסף, ל-Simple Neurite Tracer יש תכונת עיבוד נפחית, אך נעשה שימוש ב-Imaris מהסיבות המפורטות להלן.

  1. העלה תמונת z-stack של CGN אלקטרופוט ל-Imaris. גש לערכת הכלים לשחזור תלת-ממד על-ידי לחיצה על Surpass.
  2. כדי לבנות מחדש את ה- CGN, הקש Surfaces ובחר אזור עניין המקיף את כל התא בחלון התמונה. לאחר שתסיים, לחץ על החץ הכחול קדימה בפינה השמאלית התחתונה תחת צור.
  3. אם התמונה מכילה מספר ערוצים עבור אותות שונים, בחר את הערוץ המכיל את ה-CGN האלקטרופוט ולחץ על החץ הכחול קדימה.
  4. בעזרת סרגל הצד, הגדר סף רצוי המתאים בצורה המדויקת ביותר לאות של התא האלקטרופורטי. התקרב לפני השטח של התא כדי לקבוע במדויק את הסף. לאחר שתסיים, לחץ על החץ הירוק הכפול כדי לשחזר את התא ולקבל את שטח הפנים וגודל הנפח מהמטא נתונים.

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

תוצאות

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
figure-results-1

הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה
שםחברהמספר קטלוגהערות
ImarisBitplane
Zeiss 780 Upright ConfocalZeiss}780}

הדפסות חוזרות והרשאות

בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה

בקש הרשאה

תגיות

Z StackIn Vivo

מאמרים קשורים