$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
הדמיה דו-פוטונית in vivo של מיקרוגליה ודינמיקת סידן עצבית
1. הרגלת עכברים למנגנון המיקרוסקופ
- שלושה שבועות לאחר הניתוח, השראת הרדמה בעכבר עם איזופלורן 3%, והנח את העכבר מתחת לעדשת האובייקטיבית פי 25 של מיקרוסקופ דו-פוטוני באמצעות מכשיר סטריאוטקסי מותאם אישית (איור 1C). לצורך ההגדרה, העכבר מונח על גבי הליכון ומותר לו לרוץ בחופשיות.
- כ-10 דקות לאחר מכן, הוציאו את העכבר משלב המיקרוסקופ והחזירו אותו לכלוב הביתי. חזור על ההרגלה לפחות 3 פעמים בכל יום לסירוגין לפני רכישת תמונה של שני פוטונים.
2. רכישת תמונה דו-פוטונית
הערה: אנו ממליצים לבצע את רכישת התמונה יותר מ-4 שבועות לאחר הניתוח, מכיוון שהפעלת המיקרוגליה חוזרת בהדרגה לרמה הבסיסית.
- השרה הרדמה בעכבר עם איזופלורן 3% והנח את העכבר מתחת לעדשת האובייקטיבית של מיקרוסקופ שני הפוטונים באמצעות מכשיר סטריאוטקסי בהתאמה אישית.
- התקן את התקן ההצללה המותאם אישית ( איור 1A ו- איור 1B) וצג LCD לגירוי חזותי כמתואר להלן ( איור 1D).
- מקם את העדשה כדי להתמקד במשטח המוח, ולאחר מכן הגדר את מיקום העדשה כמיקום Z המקורי. שמור על קואורדינטות x-y קבועות והעלה את עדשת האובייקטיב; הסר את העכבר והמכשיר הסטריאוטקסי מעדשת האובייקט ומההליכון.
- חבר מכשיר הצללה בחלק העליון של לוחית הראש באמצעות סיליקון, המושחר על ידי ערבוב עם אבקת פחם, וודא שהרווח בין לוחית הראש למכשיר ההצללה אטום היטב.
- מלאו את מכשיר ההצללה במים מזוקקים, ואז תקנו שוב את העכבר ואת המסגרת הסטריאוטקסית מתחת למטרה ועל ההליכון. אפס בזהירות את מישור המוקד על פני השטח של המוח, ובדוק את עומק עדשת האובייקטיבי.
הערה: כדי למנוע את הסיכון לפגיעה בעדשת האובייקטיבי, הגדר תחילה את קואורדינטות ה-xyz, ולאחר מכן החל את מכשיר ההצללה של עדשת האובייקטיבי. סביר גם להתקין תחילה את הכיסוי, ולאחר מכן להתאים את הקואורדינטות, אך יש צורך בטיפול זהיר לאפשרות זו. - כסו את עדשת המטרה בנייר אלומיניום שחור כדי למנוע זיהום אור מצג ה-LCD המשמש לגירוי חזותי דרך עדשת המטרה (איור 1D). הציבו צג LCD בגודל 10 אינץ' בגודל 12.5 ס"מ מול עיני העכבר כדי להציג גירויים חזותיים (איור 1D).
- הגדר את מסנני איסוף פליטת הקרינה לפלואורסצנטי EGFP (מסנן פליטה של 525/50 ננומטר) ולפלואורסצנציה R-CaMP (מסנן פליטה של 593/46 ננומטר) ואת אורך גל העירור ל-1,000 ננומטר. רכוש תמונות ברזולוציה מרחבית של 0.25 מיקרומטר/פיקסל באמצעות אובייקט NA 25x 1.1 ו-GaAsP PMTs.
- מצא את אזור ההדמיה שבו ניתן לדמות בו זמנית נוירונים R-CaMP (+) ומיקרוגליה EGFP (+) בשכבה 2/3. עבור הגדרה זו, הנתונים שהתקבלו ב-איור 2 היו בעומק של 100 מיקרומטר משטח הפיאל, באמצעות תצוגה מקדימה של תמונה חיה. שמור על עוצמת לייזר העירור נמוכה ככל האפשר כדי למנוע הלבנת צילום ונזק הנגרם כתוצאה מעלייה בטמפרטורה המקומית באזור ההדמיה.
- השג תמונות בקצב פריימים של 30 הרץ. במקביל לרכישת התמונה, הצג גירוי חזותי נסחף ב-100% ניגודיות, 1.5 הרץ, 0.04 מחזורים למעלה ב-12 כיוונים ב-6 כיוונים מ-0° עד 150° בצעדים של 30° לעכבר.
- לאחר רכישת התמונה, יש להוציא את העכבר משלב המיקרוסקופ, לנתק את מכשיר ההצללה ואת המכשיר הסטריאוטקסי מהעכבר, ולהחזיר את העכבר לכלוב הביתי שלו.
