כימות נוירונים חדשים שנוצרו ברקמת מוח של חולדה באמצעות טכניקת המפרק האופטי

Abstract

מקור: Olesen, M. V., et al. טכניקת המפרק האופטי להערכת מספרי תאים במודל חולדה של טיפול בנזעי חשמל. {{}}J. Vis. exp. (2017).

הסרטון מדגים את הטכניקה לכימות נוירונים חדשים שנוצרו ברקמת המוח. פרוסות רקמת ההיפוקמפוס המכילות נוירונים המסומנים בברומודוקסיורידין (BrdU) נצבעו באמצעות אימונוהיסטוכימיה ולאחר מכן כומתו על פני עובי הרקמה באמצעות טכניקת המפרק האופטי.

Protocol

כל ההליכים הנוגעים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. עיבוד רקמות

הערה: בעקבות זלוף טרנס-קרדיאלי ופוסט-קיבוע ב-4% פרפורמלדהיד (PFA) מדולל במאגר פוספט של 0.2 M למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס, המוח מועבר ל-30% סוכרוז במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) למשך שלושה ימים ב-4 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, המוחות מוקפאים על אבקת קרח יבש ומאוחסנים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לחתך.

1. הפרד את ההמיספרה הימנית והשמאלית לאורך קו האמצע של המוח באמצעות אזמל. לאחר מכן, בחרו בהמיספרה זו או אחרת באופן אקראי במוח הראשון. לאחר מכן, העבר באופן שיטתי בין ההמיספרה הימנית והשמאלית (איור 1A). התקן את חצי הכדור שנדגם על דיסק דגימה כשהציר הארוך מאונך לדיסק באמצעות מדיום הרכבה.
2. הנח בקריוסטט מיכלים מרובי צלחות ממוספרים לקירור מוקדם.
3. הרכיבו את דיסקת הדגימה לתוך הקריוסטט וחתכו את כל ההיפוקמפוס (ברגמה 1.80 עד - 7.04) למקטעים בעובי 80 מיקרומטר במישור העטרה (איור 1B).
   1. מקם את כל הקטעים שנדגמו ברצף במיכלים מרובי הצלחות המקוררים כדי לשמור על החלקים בסדר חיתוך.
   2. כסו את החלקים לחלוטין בחומר הקפאה והחזיקו את המיכלים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

2. צביעה חיסונית

הערה: כדי לעקוב אחר החלקים הבודדים לאורך הליך הצביעה, הנח את החלקים שנדגמו ברשתות צביעה של 25 בארות. השתמש בכל קטע 5, תוך מתן מספר סופי ממוצע של 12 (8-16) חלקים לכל היפוקמפוס לצביעה חיסונית וספירת תאים לאחר מכן.

1. לפני דגימת משנה של כל מקטע n עם התחלה אקראית בין מקטעים אחד ו-n (איור 1C), העבר את המיכלים מ-20 מעלות צלזיוס לטמפרטורת החדר (RT).
2. השתמש במכחול, למשל, כדי להעביר את החלקים בסדר מספרי לרשתות צביעה של 25 בארות המונחות בצלחות פטרי מלאות במי מלח עם פוספט (PBS).
   NOTE: מנקודה זו, שמור את החלקים ברשתות הצביעה מונחים בכלי זכוכית תואמים על שייקר אורביטלי (סעיפים 2.3 עד 2.9).
3. העבירו את רשתות הצביעה לכלי הזכוכית התואמים ושטפו את החלקים פעמיים במשך 10 דקות ב-PBS בטמפרטורת החדר (RT) לפני הדגירה במי חמצן 3% (H₂O₂) מדולל במים מזוקקים (dH₂O) למשך 20 דקות.
4. העבירו את החלקים לשלוש תמיסות שונות של חומצה הידרוכלורית (HCl) (1 מ' ב-0 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות, 2 מ' ב-RT למשך 10 דקות ו-2 מ' ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות) לפני נטרול ב-0.1 מ' נתרן טטרבוראט ב-RT למשך 20 דקות.
5. לאחר 3 × 10 דקות דגירה ב-1% Triton X-100 מדולל ב-PBS (מאגר כביסה), העבירו את החלקים למאגר כביסה המכיל 10% סרום בקר עוברי (תמיסת חסימה) למשך שעה אחת ב-RT.
6. דגרו את החלקים למשך 48 שעות ב-4 מעלות צלזיוס בעכבר-אנטי-BrdU (5-bromo-2'-deoxyuridine) מדולל 1:100 בתמיסת חסימה.
7. שטפו את החלקים 3 × 10 דקות במאגר כביסה ודגרו במשך 48 שעות בצנון סוסים פרוקסידאז מדולל 1:10 במאגר כביסה.
8. העבר את המקטעים ל style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂O₂ למשך 10 דקות ב-RT.
9. השלם סדרת שטיפות (2 × 10 דקות ב-PBS ו-2 ×-10 דקות במאגר פוספט ללא תוספת נתרן כלורי) והרכיב את החלקים בסדר מספרי על שקופיות מיקרוסקופ.
10. יבש את החלקים במשך כ -30 דקות לפני צביעת נגד בסגול קרסיל.
11. הנח את שקופיות המיקרוסקופ במתלה שקופיות.
12. החזר את החלקים למשך 10 דקות בכלי צביעת שקופיות המכילים dH₂O, ולאחר מכן העבר את השקופיות ל- 0.02% סגול קרסיל ב- dH₂O למשך 15 דקות.
13. חזור על שלב 2.12 לפני שהחלקים מיובשים שלוש פעמים באתנול (96% למשך 5 דקות ו-99% למשך 2 × 2 דקות).
14. הנח את החלקים בקסילן למשך 2 × 15 דקות, וכסה את המגלשות באמצעות מדיום המתייבש במהירות להרכבה.
15. לבסוף, השאר את השקופיות המכוסות למשך כ-24 שעות לפני שניתן יהיה להשתמש בהן למיקרוסקופיה.

3. אומדן המספר הכולל של נוירונים המסומנים ב-BrdU באמצעות המקטע האופטי

הערה: ערכו מחקר פיילוט הכולל כמה בעלי חיים כדי לקבוע את פרמטרי הדגימה האופטימליים, כגון מספר הקטעים שיש לנתח ומספר הדיסקטורים האופטיים בתוך המקטעים שנדגמו. פיילוט זה מספק גם קורות חיים ראשוניים (סטיית תקן/ממוצע) ואפשרות להתאים את ה-CE כדי לקבל דיוק משביע רצון של האומדנים שנקבעו על ידי החוקר (לפרטים נוספים, ראה להלן). כמו כן, ניתוח התפלגות z יתייחס לנקודות הבאות: התכווצות רקמות, איכות הצביעה לאורך החתך והתפלגות התאים בציר z.

1. בדוק את עובי הרקמה בקטעים כדי לוודא שהם מתאימים לשימוש של המפרק האופטי, למשל, עבה מספיק לגובה הדיסקטור הנבחר, כולל אזורי שמירה (ראה להלן). הערה: עובי הרקמה נמדד במספר מקומות באזור העניין.
   1. הנח את השקופיות על הבמה הממונעת של המיקרוסקופ והפעל את התוכנה הסטריאולוגית המועדפת.
   2. תוחם את אזור העניין באמצעות אובייקט בהגדלה נמוכה (2X או 4X) לפני השינוי לאובייקט טבילה בשמן של 100X (ראה איור 2A).
   3. שימוש בנקודה מסוימת של מסגרת ספירה (למשל, בפינה או בסמוך לה), אתר את החלק העליון של המקטע על-ידי תנועה לאורך מישור המוקד עד שתופיע תכונת חיתוך כלשהי במיקוד. רשום את מיקום z זה כ- 0 (ראה איור 2B).
   4. הזז את מישור המוקד כלפי מטה דרך הרקמה עד שאותה נקודה ספציפית של מסגרת הספירה תהיה ברמת ה-z האחרונה של הרקמה במיקוד וסמן מיקום זה. עובי הרקמה המקומי מוגדר מ-0 עד לנקודת קצה זו וניתן לקרוא אותו על ציר ה-z. רשום את עובי הרקמה (ראה איור 2B).
2. תעד חדירה מלאה של הכתם ופיזור התאים במלוא עובי החתך.
   NOTE: התפלגות הנוירונים המסומנים ב-BrdU משמשת כמדריך לקביעת אזורי השמירה הנדרשים. למרות שהתפלגות אחידה של תאים היא קריטית, התבוננות בפחות תאים ליד החלק העליון והתחתון של הקטע מקובלת, מה שמעיד על ההשפעה של מכסים אבודים.
   1. דגימת נוירונים עם תווית BrdU ורשום את מיקום ה-z שלהם יחד עם עובי החתך המקומי שנמדד בפינה שנבחרה של כל מסגרת ספירה.
   2. שרטט את מספר הנוירונים החיוביים ל-BrdU כפונקציה של מיקום ה-z שלהם.
3. יש לקבוע את גובה אזורי המנהל והשמירה על סמך עובי החתך הממוצע והתפלגות התאים (ראה 3.1 ו-3.2).
   NOTE: גובה הדיסקטור צריך להיות פחות מעובי החתך כדי למנוע חפצים קרובים למשטחים. סיכון זה נעקף על ידי הכללת אזורי שמירה בחלק העליון והתחתון של הקטע.
4. קבע את אורך הצעד בין הדיסקטורים.
   1. תוחם את אזור העניין בכל הקטעים שיש לנתח ורשום את האזורים.
   2. סכם את האזורים הללו וחלק במספר הדיסקטורים שהוצבו באזור זה.
      NOTE: בהתבסס על ניסיון קודם, נקודת התחלה טובה כרוכה ב-75 בדיקות. פעולה זו תעריך את האזור ואת מיקומי הדגימה המתאימים (A_step).
   3. קח את השורש הריבועי של A_step, שיספק את גודל x-y-step.
5. קבע את גודל מסגרת הספירה.
   1. הגדר את גודל מסגרת הספירה ליחידה שרירותית ובצע דגימת פיילוט של נוירונים חיוביים ל-BrdU באמצעות הפרמטרים שהתקבלו בסעיפים 3.3 ו-3.4.
      NOTE: יש לקבוע את הגודל באופן אמפירי על ידי ניסוי וטעייה, אך מומלץ לבצע התאמה כדי לאפשר דגימה של 2-3 תאים לכל דיסקטור.
6. לאחר השלב האחרון הזה של מחקר הפיילוט, התחל בדגימת תאים.
   NOTE: פרמטרי הדגימה המתקבלים אמורים להביא לספירה של כ-150-200 תאים בכל בעל חיים, מספיק כדי להשיג עיצוב סטריאולוגי יעיל.
7. ספרו את הנוירונים החיוביים ל-BrdU באמצעות יעד טבילה בשמן של 100× והגדלה סופית של 2000-3000×. בכל דיסקטור אופטי, זהה את כל הנוירונים המסומנים ב-BrdU המזוהים על ידי התכונה המעניינת (במחקר הנוכחי, הקריטריון הוא כאשר הקצה המוביל של תא העצב המסומן ב-BrdU נכנס לפוקוס בפעם הראשונה), ממוקמים בתוך מסגרת הספירה או גע בקווי ההכללה (איור 2B). אל תספור את הנוירונים החיוביים ל-BrdU הנוגעים בקווי ההדרה כאשר הם מזוהים בבירור על ידי תכונת העניין בתוך גובה הדיסקטור. חשוב מאוד לעקוב בקפידה אחר כללי הספירה הללו לאורך כל הכימות הסטריאולוגי.
   NOTE: מכיוון ש-BrdU משתלב בכל התאים המתחלקים, המורפולוגיה מבחינה בין נוירונים לסוגים אחרים של תאים. מאפייני הנוירונים הם גרעין מוגדר בבירור עם ציטופלזמה ניטרלית וגרעין כהה. תאים חיוביים ל-BrdU מזוהים כתאי עצב חדשים שנוצרו על סמך גודלם הגדול יותר מתאי גליה. במחקרים על התפשטות לטווח קצר (למשל, < 2,4 שעות), צביעה כפולה באמצעות סמנים עצביים לא בשלים עשויה להיות תנאי מוקדם.

Results

Materials