הדמיה חיה של עין הגולם של דרוזופילה באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

תקציר

מקור: Hellerman, M. B., et al. Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye. J. Vis. Exp. (2015)

הסרטון מדגים טכניקת הדמיה חיה לחקר דפוסי עיניים בגולם Drosophila melanogaster. סמנים מתויגים בחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) מאפשרים הדמיה של ארגון התאים והתמיינות במהלך היווצרות מבנה העין המתפתח.

פרוטוקול

1. הדמיה פלואורסצנטית

1. תמונה את <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Drosophila הכנת גולם באמצעות מיקרוסקופ פלורסנט. כל 7 דקות ללכוד חתכים סדרתיים דרך התחום האפיקלי של נוירואפיתל העין, באזור הצמתים הנצמדים.
   NOTE: א) חתכים טוריים מתאימים הם בדרך כלל 4-5 לכל מחסנית z, המורכבים מ-0.2 מיקרומטר צעדי z. ב) אי סדרים בטופולוגיה של האפיתל, כולל בליטות וקפלים קלים, עלולים להקשות על רכישת תמונות ממוקדות של אזורים גדולים של רקמה. בזמן ההדמיה, ניתן למצוא חלק מתחום עניין במוקד ואזור שכן לא ממוקד. הכללת טיפה קטנה של מים מזוקקים בין עין הגולם לכיסוי יכולה לחסל כמה קפלי רקמה חריפים, אך לא את הטופולוגיה הלא אחידה מעט האופיינית לשלבים המוקדמים של מורפוגנזה של עין הגולם. במקרים אלה, דגימת יתר של הרקמה על ידי הרחבת מחסנית ה-z עד לקבלת פרוסות ממוקדות עבור השדה כולו. ג) לכידת מקטעים טוריים כל 7 דקות אמורה לאפשר הדמיה חיה למשך 3 עד 4 שעות ללא הפחתה משמעותית בעוצמת הקרינה של חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שעלולה לפגוע באיכות התמונה. מרווחי זמן קצרים יותר עשויים להפחית את זמן ההדמיה הכולל.
2. המשך בהדמיה במשך 3 עד 4 שעות. אל תשתמש בפונקציית מיקוד וזמן אוטומטית הזמינה במיקרוסקופים פלואורסצנטיים רבים מכיוון שגדילת הגולם ושאיבת המולימפה מזיזים את מיקום הרשתית ונדרש מיקוד מחדש ערני כל 14-21 דקות.

הערה: הדמיה מעבר ל-4 שעות עלולה להאט או לעכב את המורפוגנזה של העין.

3. השתמש בתוכנת דה-קונבולוציה מתאימה כדי להקטין את הרקע ולשפר את הניגודיות של תמונות המקטעים הטוריים. עבור כל קובץ z-stack, בצע את הפעולות הבאות בתוכנת Leica application application advanced fluorescence (LAS AF): נווט אל החלונית Tools, בחר 3D Deconvolution ולחץ על Apply.
4. צור תמונת הקרנה מקסימלית (MP) עבור כל קובץ אוסף לא מפותל: נווט אל החלונית Tools, בחר 3D Projection ולחץ על Apply.
   <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'הערה: אלגוריתם MP עלול להיכשל ביצירת תמונה ממוקדת באופן אחיד עבור רקמה שעברה דגימת יתר.

2. עיבוד תמונה

1. יישור תמונה אוטומטי:

הערה: <span style='משפחת גופנים:Arial,sans-serif;גודל גופן:12pt;משתנה גופן:רגיל;משקל גופן:400;קישוט טקסט:ללא;יישור אנכי:קו בסיס;רווח לבן:גלישה מוקדמת;'>Drosophila הרקמה תזוז ותגדל לאורך תהליך ההדמיה. כתוצאה מכך, מרכזי התמונות שנאספו בנקודות זמן עוקבות עשויים שלא להתאים לאותה נקודה ב Drosophila. בנוסף, כל דיסק הרשתית מסתובב כ-30 מעלות בין ~21 ל-23 שעות לאחר היווצרות הגולם (APF). כדי להדגיש התנהגויות של תאים בודדים ולהפחית הסחות דעת הנגרמות על ידי צמיחת אורגניזם, יישר כל תמונת MP. אמנם ניתן לבצע זאת באופן ידני, אך לתוכנת עריכת התמונות המשמשת כאן יש אלגוריתמים מובנים שיכולים לזרז את התהליך.

2. בכרטיסייה File בתפריט הראשי, פתח את Scripts ובחר Load Files into Stack.
3. ייבא את קובצי תמונת MP לחלונית Load Layers ובחר OK. ודא שהאפשרות Attempt to Align Source Images לא נבחרה אוטומטית.
4. הערה: אם בוחרים באפשרות זו, התוכנה עשויה להשתמש באלגוריתם יישור המעוות את נתוני התמונה.
5. לאחר שכל קובצי ה-MP נטענו בחלונית השכבות, ודא שכל התמונות מופיעות בסדר כרונולוגי כך שנקודת הזמן המוקדמת ביותר נמצאת בחלק העליון של ערימת השכבות. אם השכבות אינן בסדר הנכון, גררו ושחררו אותן עד לסידור הנכון.
6. בחר יישור שכבות אוטומטי מהכרטיסייה Edit בתפריט הראשי. בחר Reposition ולחץ על OK.
7. אם אלגוריתם היישור האוטומטי לא מצליח לכוון את המסגרות לנקודת מיקוד רלוונטית, בצע התאמות קלות באמצעות הכלי Move.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
GMR-GAL4; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP ; + / SM5-TM6b
UAS-DCR-2; UAS-a-cat:GFP, ubi-DE-Cadherin:GFP; + / SM5-TM6b
25 x 75 x 1 מ"מ שקופית מיקרוסקופ זכוכית	פישר סיינטיפיק	12-550-413
22 x 40 מ"מ כיסוי זכוכית	VWR	48393-172
מלקחיים	Fine Science Tools	91150-20
Whatman 3 מ"מ נייר כרומטוגרפיה	פישר סיינטיפיק	05-713-336
וזלין	פישר סיינטיפיק	19-086-291
30 מ"ל מזרק	פישר סיינטיפיק	S7510-30
Adobe Photoshop CS5	Adobe
Leica TCS SP5 DM מיקרוסקופ	Leica Microsystems
LAS AF גרסה 2.6.0.7266 תוכנת מיקרוסקופ	Leica Microsystems