הדמיה אורכית דו-פוטונית של נוירונים המסומנים פלואורסצנטית בהיפוקמפוס של עכבר חי

תקציר

מקור: }Ulivi, A. F., et. al. הדמיה אורכית דו-פוטונית של ההיפוקמפוס הגבי CA1 בעכברים חיים. J. Vis. exp. (2019)
}

}סרטון זה מדגים הדמיה אורכית של שני פוטונים של נוירונים פירמידליים בעלי תווית פלואורסצנטית בעכבר חי, הצגת ההכנה, יישור הצינורית וההדמיה של דנדריטים ועמוד שדרה דנדריטי כדי לחקור את המבנה העצבי באזור CA1 בהיפוקמפוס.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת סשן ההדמיה
2. הפעל את מערך ההדמיה מראש ותן ללייזר להתחמם ולהתייצב, במידת הצורך.
3. להרדים את העכבר. הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה ב-3% איזופלורן ב-1 ליטר לדקה O₂ והמתן עד שהוא יאבד את הכרתו. הערכת הרדמה באמצעות בדיקת רפלקס צביטת הבוהן.
4. השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את סרט הדבק מלוחית מחזיק הראש. החזק את העכבר ביד ואת לוחית מחזיק הראש עם האצבעות. הסר את הסרט בעדינות, כדי למנוע פגיעה בתכשיר.
5. מקמו את העכבר מתחת למיקרוסקופ, מעל שטיח החימום, והצמידו את לוחית הראש למחזיק (איור 1D).
6. מקם את חרוט האף כדי לכסות את החוטם ולהפחית את האיזופלורן ל-1.5-2%.
7. מרחו משחה עיניים על עיני העכבר.
8. נקה את צינורית ההדמיה על ידי שטיפתה במים נטולי יונים. השתמש במזרק ובמחט דקה כדי להפיל מים לתוך הצינורית ובמשאבת ואקום כדי להסיר אותה.

2. סשן הדמיה

1. {{}} השתמש בהגדלה נמוכה ובמטרות למרחקי עבודה ארוכים כדי לבדוק ויזואלית את הצינורית לאיתור שאריות מים, לכלוך, שלמות ונוכחות פלואורסצנטית.
2. יישר את הצינורית לציר האופטי על ידי התאמת הזוויות של זרועות מחזיק הראש.
3. עבור ליעדי הטבילה במים 25X 1.0 NA (צמצם מספרי), 4 מ"מ WD (מרחק עבודה), או 40X 0.8 NA, 3 מ"מ WD. הוסף מספיק מים נטולי יונים כדי למלא את הצינורית ולשמור על עודפי מים על גבי הצינורית. הימנע מהיווצרות בועות אוויר.
4. השתמש בעירור דו-פוטוני (2P) ובאותות פלואורסצנטיים של תמונה.
   הערה: פרוטוקול ההדמיה תלוי מאוד בזמן ובקנה המידה המרחבי שיש לצלם. אנא עיין בתוצאות המייצגות של הסעיף ובדיון לקבלת פרטים על הגדרות ההדמיה שבהן השתמשנו כדי להפיק את התמונות המוצגות במאמר זה.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צינור נירוסטה Ø 3,0 x 0,25 מ"מ (פנימי Ø 2,5 מ"מ) L = 500 מ"מ	Sawade	R00303	צינור נירוסטה לטבעת מתכת הצינורית
מיקרוסקופ כיסוי זכוכית (4 מ"מ עגול)	Engelbrecht Medizin and Labortechnik		כיסויי זכוכית לזכוכית הצינורית
Isofluran CP, Flasche 250 ml	Henry Schein VET GmbH	798932	נוזל איזופלוראן להרדמה
Harvard Apparatus Isoflurane Funnel-Fill Vaporizer	Harvard Apparatus GmbH	34-1040	Isoflurane vaporizer
Lab Active Scavenger	Gropper Medizintechnik	UV17014	Isoflurane Scavenger System
CMA 450 Temperature Controller	הוגו סאקס אלקטרוניק - Harvard Apparatus GmbH	8003770	שמיכת חימום
Bepanthen Augen- und Nasensalbe	Bayer AG		Ophtalmic ointment
Head plates	מותאם אישית made		30 מ"מ x 10 מ"מ גודל; חור בקוטר 8 מ"מ, טיטניום
Head plate clamp	מותאם אישית		מחזיק לוחית ראש
מחזיקי עמודים על הדום	Thorlabs	PH20E/M	מחזיק לוחית ראש
פוסט נירוסטה	Thorlabs	TR30/m	מחזיק לוחית ראש
פוסט נירוסטה	Thorlabs	TR75/M	מחזיק לוחית ראש
פוסט נירוסטה	Thorlabs	TR150/M	מחזיק לוחית ראש
Post connector clamps	מותאם אישית		מחזיק לוחית ראש
לוח לחם אלומיניום, 300 מ"מ x 450 מ"מ x 12.7 מ"מ, M6 taps	Thorlabs	MB3045/M	שלב מיקרוסקופ
7" x 4" Lab Jack	Thorlabs	L490/M	שלב מיקרוסקופ
מסיכת פנים בפרופיל נמוך, עכברים קטנים	Emka Technologies	VetFlo-0801	מחזיק מסכת פנים להרדמה
Power meter דגם 1918-R	Newport		מד כוח
X-Cite 120Q	Excelitas Technologies		מנורת פלואורסצנטי
מיקרוסקופ שני פוטונים	Bruker	Ultima IV	מיקרוסקופים עם שני פוטונים
מיקרוסקופ של שני פוטונים	Thorlabs	Bergamo	מיקרוסקופים עם שני פוטונים
Plan N 4x/0.10 ∞/-/FN22	Olympus		יעדים
Plan N 10x/0.25 ∞/-/FN22	Olympus		Goals
LMPlan FLN 20x/0.40 ∞/-/FN26.5	Olympus		יעדים
XLPlan N 25x/1.00 SVMP ∞/0-0.23/FN18	Olympus		Goals
לייזר מתכוונן Ultafast לעירור 2P	Spectraphysics	Mai Tai Deep See	Excitaiton lasers
לייזר מתכוונן Ultafast לעירור 2P	Spectraphysics	InSight DS+ Dual beam	Excitaiton lasers
לייזר מתכוונן Ultafast לעירור 3P	קוהרנטי	Monaco	Excitaiton לייזרים