הדמיה אורכית דו-פוטונית של נוירונים המסומנים פלואורסצנטית בהיפוקמפוס של עכבר חי

תקציר

מקור: }Ulivi, A. F., et. al. הדמיה אורכית דו-פוטונית של ההיפוקמפוס הגבי CA1 בעכברים חיים. J. Vis. exp. (2019)
}

}סרטון זה מדגים הדמיה אורכית של שני פוטונים של נוירונים פירמידליים בעלי תווית פלואורסצנטית בעכבר חי, הצגת ההכנה, יישור הצינורית וההדמיה של דנדריטים ועמוד שדרה דנדריטי כדי לחקור את המבנה העצבי באזור CA1 בהיפוקמפוס.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת סשן ההדמיה
2. הפעל את מערך ההדמיה מראש ותן ללייזר להתחמם ולהתייצב, במידת הצורך.
3. להרדים את העכבר. הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה ב-3% איזופלורן ב-1 ליטר לדקה O₂ והמתן עד שהוא יאבד את הכרתו. הערכת הרדמה באמצעות בדיקת רפלקס צביטת הבוהן.
4. השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את סרט הדבק מלוחית מחזיק הראש. החזק את העכבר ביד ואת לוחית מחזיק הראש עם האצבעות. הסר את הסרט בעדינות, כדי למנוע פגיעה בתכשיר.
5. מקמו את העכבר מתחת למיקרוסקופ, מעל שטיח החימום, והצמידו את לוחית הראש למחזיק (איור 1D).
6. מקם את חרוט האף כדי לכסות את החוטם ולהפחית את האיזופלורן ל-1.5-2%.
7. מרחו משחה עיניים על עיני העכבר.
8. נקה את צינורית ההדמיה על ידי שטיפתה במים נטולי יונים. השתמש במזרק ובמחט דקה כדי להפיל מים לתוך הצינורית ובמשאבת ואקום כדי להסיר אותה.

2. סשן הדמיה

1. {{}} השתמש בהגדלה נמוכה ובמטרות למרחקי עבודה ארוכים כדי לבדוק ויזואלית את הצינורית לאיתור שאריות מים, לכלוך, שלמות ונוכחות פלואורסצנטית.
2. יישר את הצינורית לציר האופטי על ידי התאמת הזוויות של זרועות מחזיק הראש.
3. עבור ליעדי הטבילה במים 25X 1.0 NA (צמצם מספרי), 4 מ"מ WD (מרחק עבודה), או 40X 0.8 NA, 3 מ"מ WD. הוסף מספיק מים נטולי יונים כדי למלא את הצינורית ולשמור על עודפי מים על גבי הצינורית. הימנע מהיווצרות בועות אוויר.
4. השתמש בעירור דו-פוטוני (2P) ובאותות פלואורסצנטיים של תמונה.
   הערה: פרוטוקול ההדמיה תלוי מאוד בזמן ובקנה המידה המרחבי שיש לצלם. אנא עיין בתוצאות המייצגות של הסעיף ובדיון לקבלת פרטים על הגדרות ההדמיה שבהן השתמשנו כדי להפיק את התמונות המוצגות במאמר זה.

תוצאות

חומרים