חקירת המקורות של נוירונים חושיים בדורה מאטר באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית

תקציר

מקור: }Wang, J., . הדמיה של העצב האימונוריאקטיבי של פפטיד הקשור לגן קלציטונין של הגולגולת של חולדה עם אימונופלואורסצנציה ומעקב עצבי. J. Vis. exp. (2021).

}סרטון זה מדגים שיטה להתחקות אחר מקורותיהם של נוירונים חושיים בדורה מאטר באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עוקב רטרוגרדי מוחדר לדורה מאטר החשוף של חולדה מורדמת. העוקב נקלט על ידי אקסונים עצביים חושיים ונוסע לאחור לגופי התאים שלהם בתוך הגנגליון הטריגמינלי וגרעיני השורש הגבי הצווארי. לאחר מכן הגנגליונים נחתכים, מוכתמים בנוגדנים המסמנים את העוקב והנוירופפטידים בגופי התא, ומנותחים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר את המקורות הגנגליונים של הנוירונים החושיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים והווטרינר של JoVE מועצת ביקורת.

1. מחקר מעקב לאחור עם fluorogold (FG)

1. הליכים כירורגיים
   1. קבע את אזור הקואורדינטות של העניין בדורה מאטר גולגולת של חולדות.
   2. הכינו מיקרו-מזרק של 10 מיקרוליטר ובדקו אותו עם פרפין נוזלי.
   3. להרדים את החולדות בתמיסת טריברומו-אתנול (150 מ"ג/ק"ג) באמצעות הזרקה תוך צפקית. בדוק את העומק בהרדמה על ידי חוסר תגובה לצביטה בבוהן.
   4. לגלח את ראש החולדה עם סכין גילוח חשמלי.
   5. שים מוטות אוזניים קהים על החולדה והנח אותו על המכשיר הסטריאוטקסי. לאחר מכן הניחו את מחזיק הפה ומרחו משחה עיניים על העיניים.
   6. נקו את האזור הניתוחי של עור הראש באמצעות 10% פובידון יוד ואחריו 75% אתנול.
   7. בצע חתך לאורך קו האמצע של הקרקפת.
   8. הסר באופן בוטה את הפריאוסטאום ורקמות השריר הרחק מהגולגולת באמצעות אפליקטורים סטריליים בעלי קצה כותנה (איור 1A).
   9. קדחו חור קטן (~5-7 מ"מ) באמצעות מקדחה עם קצה עגול (#106) על העצמות הקודקודיות והטמפורליות השמאליות מעל עורק קרום המוח האמצעי (MMA), וודאו שהגולגולת נשמרה שלמה (איור 1B).
   10. בנה בנק סביב החור עם מלט סיליקט דנטלי כדי להגביל את התפשטות העוקב (איור 1C).
   11. הוסף 2 מיקרוליטר של 2% FG לתוך החור סביב MMA עם מיקרו-מזרק של 10 מיקרוליטר (איור 1D).
   12. מכסים את החור בחתיכה קטנה של ספוג המוסטטי.
   13. שים חתיכת סרט פרפין על החור ואטום את הקצוות בשעוות עצם כדי למנוע דליפת עוקב וכדי למנוע זיהום הרקמות שמסביב.
   14. לתפור את הפצע בחוט סטרילי.
   15. שמור את החולדות באזור חמים עד שהן יתאוששו לחלוטין.
   16. החזירו את החולדות לכלובים שלהן והוסיפו אנטיביוטיקה ומשכך כאבים למי השתייה.
2. זלוף ומקטעים
   1. לאחר 7 ימי הישרדות, חלף את החולדות הללו.
   2. נתח את הגנגליון הטריגמינלי (TG) ואת גרעיני השורש הגבי C1-4 (DRGs), ולאחר מכן תקן אותם והגן עליהם בהקפאה (איור 1F).
   3. חותכים את ה-TG וה-DRG בעובי של 30 מיקרומטר על מערכת מיקרוטום קריוסטט בכיוון הסגיטלי ומורכבים על שקופיות זכוכית מצופות סילאן.
3. אימונופלואורסצנטיות כפולות לתיוג פפטיד הקשור לגנים FG וקלציטונין (CGRP) ב-TG ו-DRGs
   הערה: למרות שניתן לצפות ישירות בתיוג FG עם תאורה אולטרה סגולה (UV) מתחת למנורת כספית ללא צביעה נוספת, הנוירונים המסומנים עם FG נבדקו עוד יותר ב-TG וב-DRG צוואר הרחם באמצעות אימונופלואורסצנטיות כפולות עם FG ו-CGRP כדי לחשוף את המקורות של CGRP-אימונו-ריאקטיבי דוראלי סיבי עצב ב-TG ו-DRG.
   1. הקף את הקטעים עם העט ההיסטוכימי.
   2. דגרו את החלקים למשך 30 דקות בתמיסת חסימה המכילה 3% סרום חמור רגיל ו-0.5% טריטון X-100 במאגר פוספט 0.1M (PB).
   3. העבירו את הדגימות לתמיסה של אנטי-פלואורוגולד ארנב (1:1000) ונוגדנים נגד CGRP של עכבר (1:1000) ב-0.1 M PB המכילים 1% סרום חמור רגיל ו-0.5% טריטון X-100 למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס.
   4. שטפו את החלקים שלוש פעמים ב-0.1 מ' PB למחרת.
   5. דגירה בתמיסה מעורבת של אנטי-ארנב חמור Alexa Fluor 594 (1:500) ונוגדנים משניים נגד עכבר חמור Alexa Fluor 488 (1:500) ב-0.1 M PB המכיל 1% סרום חמור רגיל ו-0.5% Triton X-100 למשך 1.5 שעות בטמפרטורת החדר.
   6. שטפו ומרחו כיסויים על החלקים.
4. תצפית והקלטה
   1. צלם תמונות של הנוירונים המסומנים ב-FG ב-TG ו-DRGs תחת תאורת UV על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית.
   2. צלם תמונות של תאי העצב המסומנים ב-FG ו-CGRP ב-TG ו-DRG תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד במצלמה דיגיטלית.
   3. השתמש בתוכנת העריכה כדי להתאים את הבהירות והניגודיות של תמונות ולהוסיף תוויות בתמונות.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Alexa Fluor 488 donkey anti-mouse IgG (H+L)<	A21202	הגן מפני אור; RRID: AB_141607
Brain stereotaxis instrument	Narishige	SR-50
CellSens Dimension	Olympus	גרסה 1.1	תוכנה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Fluorogold (FG)	Fluorochrome	52-9400	הגן מפני אור
מערכת הדמיה פלואורסצנטית	Olympus	BX53
Frozen microtome	Thermo	Microm InternationalGmbH
Micro Drill	Saeyang Microtech	Marathon-N7
Mouse anti-CGRP	Abcam	ab81887	RRID: AB_1658411
סרום חמור רגיל	Jackson ImmunoResearch	017-000-121
Phalloidin 568	בדיקות מולקולריות	A12380	הגן מפני light
Photoshop and Illustration	Adobe	CS6	תוכנת עריכת תמונות
Rabbit anti- Fluorogold	Abcam	ab153	RRID: AB_90738
Sprague Dawley	המכונים הלאומיים לבקרת מזון ותרופות	SCXK (JING) 2014-0013
Superfrost plus microscope slides	Thermo	#4951PLUS-001	25x75x1mm

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Invitrogen by Thermo Fisher Scientific