ניטור התאוששות של תאים בין-נוירומסטים בלייזר בדגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית

תקציר

מקור: Volpe, B. A., , ואחרים בדיקת אבלציה והתחדשות לייזר מבוססת מיקרוסקופ קונפוקלי בתאים בין-נוירומאסטים של דג הזברה. J. Vis. exp.{{TAG_ 31}} (2020)

} סרטון זה מדגים ניטור התאוששות תאים בין-עצביים בדגי זברה באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית, מעקב אחר מוות ותיקון תאים באמצעות הדמיה פלואורסצנטית בזמן-lapse.

פרוטוקול

1. הדמיה לאחר אבלציה ומיקרוסקופיה דולג זמן לחקר התחדשות

1. לחץ על התפריט הנפתח עבור " ערוצים". בערוצים, בטל את הלחיצה על המסלול "DAPI"(4′,6-diamidino-2-phenylindole) כדי להשבית את לייזר האבלציה. לחץ על התפריט הנפתח עבור " מצב רכישה".
2. במצב רכישה, לחץ על "Zoom".
3. הקטן את גודל התצוגה ל-0.7 באמצעות המחוון או על-ידי הקלדת "0.7."
   1. {כדי להבטיח אבלציה מוצלחת של תאים, הגדל את הרווח ל-900 וסרוק במהירות את שדה הראייה.
      הערה: שום GFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק) לא אמור להיות גלוי בתוך התא או התאים הממוקדים. באמצעות אותן הגדרות או דומות לאלה המתוארות להדמיה לפני האבלציה, לכוד ושמור תמונה לאחר האבלציה ( איור 1C). אם התמונה חושפת שאריות של תאים פלואורסצנטיים או גופי תאים נוספים שצריך להסיר, חזור על שלבי האבלציה בלייזר כדי ליצור פער גלוי במחרוזת התאים הבין-נוירומאסטים.
   2. בדוק את תמונת ערוץ T-PMT (שפופרת מכפיל שידור) כדי לאשר עוד יותר נזק תאי. תאים פגומים יהיו בעלי מראה גרעיני, והגרעינים לעיתים קרובות יתנפחו או יהפכו לבלתי סדירים בצורתם (}איור 2).
4. לאחר לכידת תמונה לפני אבלציה, הסרת התאים לפי הצורך ולכידת תמונה לאחר אבלציה עבור כל מיקום שלב בודד, הגדר את מיקרוסקופ ה-time-lapse על ידי הפעלת אפשרויות מיקום השלב והזמן לצילום תמונה. הגדר את פרמטרי הזמן ל-24 שעות או נקודת קצה רצויה אחרת ומרווחים של 15 דקות. התחל להתנסות כדי להשיג תמונות ולשמור את הקובץ שהתקבל לאחר השלמתו (למחרת).
5. אם יש לחקור או לגדל זחלים, הסר אותם בזהירות מהאגרוז באמצעות מלקחיים עדינים, ולאחר מכן העביר אותם למדיום E3 ללא טריקאין להתאוששות. אם אין להשתמש בהם עוד, המתת חסד על פי פרוטוקול בעלי החיים המאושר (טבילה מהירה ומתמשכת באמבטיית קרח היא שיטה נפוצה) והשליך אותם כנדרש על ידי המוסד.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
-12-well PTFE שקופיות מודפסות<	63425-05
15 mM Tricaine stock solution<	E10521	15 מ"מ טריקאין באוסמוזה הפוכה מים
1X E3 + 600 μM Tricaine			דילול מלאי טריקאין 15 מ"מ 25X במדיה 1X E3
1X E3 media	<	דילול מדיה 60X E3 ל-1X במי אוסמוזה הפוכה (16.7 מ"ל/ליטר)
60 X E3 media	כל הרכיבים שנרכשו מ-Sigma-Aldrich		34.4 גרם Nacl, 1.52 גרם Kcl, 5.8 גרם CaCl2.2H2O, 9.8 גרם MgSO4.7H20 ב-1 ליטר אוסמוזה הפוכה מים
Bx60 מיקרוסקופ מורכב עם פלואורסצנציה של מנורת קשת כספית	אולימפוס
LSM 700 קונפוקלי המצויד בלייזרים של 405 ננומטר, 488 ננומטר ו-555 או 561 ננומטר	Carl Zeiss Microscopy, LLC		לייזר 5 mW 405 ננומטר שימש לאבלציה; אבלציות והדמיה בוצעו באמצעות יעד Plan-Apochromat של 63x עם NA של 1.40
FIJI/ImageJ תוכנת עיבוד תמונה	תורמים מרובים		ניתן להורדה ב-https://fiji.sc/
ניתוח מחט שהשתנתה לסכין שיער	פישר סיינטיפיק	19010	ריס הודבק על קצה מחט חיתוך עם ידית עץ
Microsoft Excel	Microsoft Corp.		גיליונות Google היא אלטרנטיבה ללא עלות ל-Microsoft Excel
כלי זכוכית תחתונים 35 מ"מ עם כיסוי מס' 1.5, חלון 20 מ"מ	Mattek Corporation	P35G-1.5-20-C	צלחת פטרי 35 מ"מ, חלון זכוכית 20 מ"מ
Immersol 518F Immersion Oil	Fisher Scientific	12-624-66A
אגרוז ג'לינג נמוך	סיגמא מדעי החיים	A9414-256
Corning Netwell Insert עם רשת פוליאסטר 74 אום, 24 מ"מ Insert	Millipore Sigma	CLS3479-48EA
Rstudio software	Rstudio PBC		ניתן להורדה ב-https://rstudio.com/
SMX-168-BL מיקרוסקופ סטריאו	Motic
העברת פיפטה	פישר סיינטיפיק	13-711-7M
ZEN software	Carl Zeiss Microscopy, LLC	<

td style='משפחת גופנים:Roboto;גודל גופן:7pt;משקל גופן:רגיל;גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;רווח לבן:רגיל;גלישת מילים:שבירת מילה;אסטרטגיית גלישה:4;'>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרוניתtd style='font-family:Roboto;font-size:7pt;font-weight:normal;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:break-word;wrap-strategy:4;'>Sigmatd style='גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'> softwaretd style='overflow:hidden;padding:0px 3px;'>