הדמיית סידן של פעילות נוירונים מעיים וגליה במקלעת מיאנטרית של עכבר

תקציר

מקור: Fried, D. E., Gulbransen, B. D. באתרו ca²⁺{{}} הדמיה של מערכת העצבים המעי. J. Vis. exp., (2015)

{סרטון זה מדגים סידן הדמיה כדי להמחיש ולנתח את הפעילות של נוירונים מעיים וגליה בתכשירי מקלעת מיאנטרית של המעי הגס בעכבר.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הסקירה האתית המתאימה של בעלי חיים ועדה.

1.הכנה מאגר קרבס שונה.

צור מאגר קרבס מותאם כך שהריכוזים הסופיים (במ"מ) של הרכיבים יהיו כדלקמן: 121 NaCl, 5.9 KCl, 2.5 CaCl₂, 1.2 MgCl₂, 1.2 NaH₂PO₄, 10 HEPES, 21.2 NaHCO₃, 1 חומצה פירובית ו-8 גלוקוז (pH מותאם ל-7.4 עם NaOH). הוסף 3 מיקרומטר ניקרדיפין ו-1 מיקרומטר סקופולמין כדי לעכב התכווצויות שרירים במהלך Ca²⁺ ודיסקציות הרכבה שלמה.

2. הדמיה וניתוח

הערה: השתמש לפחות במתקן הדמיה בסיסי עם מקור אור פלואורסצנטי, מיקרוסקופ, מצלמת CCD איכותית ותוכנת רכישה מתאימה. שנה את התוספת של רכיבים אחרים בהתאם למקור האור וליישום הספציפי. יש להשתמש בגלגל פילטר ותריס עם מקור אור קשת קסנון מסורתי. עם זאת, מקורות אור LED ומערכות תאורה אינם דורשים רכיבים אלה.

1. מקם את תא ההקלטה מתחת למיקרוסקופ ובאמצעות מערכת זלוף זרימת כבידה עם מספר מאגרי מזרק מחוממים יוצרים קצב זלוף רציף של 2-3 מ"ל/דקה של 37 מעלות צלזיוס מאגר קרבס. הקפד למנוע היווצרות בועות אוויר הן בקו הכניסה והן בקו היניקה המחובר למלכודת ואקום.
2. הביאו את המקלעת הרצויה למיקוד תחת תאורת שדה בהירה. הימנע מחשיפת יתר של רקמות, שעלולה להוביל להלבנת פוטו.
3. בדוק את העמסת Fluo-4 בתוך הגרעינים ובחר גנגליונים בריאים להדמיה. גנגליונים לא בריאים/פגומים יציגו אוטופלואורסצנטיות או מורפולוגיה מנוקבת ואין להשתמש בהם להדמיה.
4. לאחר בחירת הגנגליון, הפנה את נתיב האור למצלמה וקבל תמונה חיה עם תוכנת רכישת תמונה. ודא שהגנגליון נמצא בפוקוס והגדר את קצב רכישת התמונה וזמני החשיפה.
   NOTE: שיעורי וזמני רכישת התמונות ישתנו בהתאם לאירועים שהחוקרים רוצים לתעד. עבור רוב הניסויים, תמונות נרכשות באופן מסורתי ב-0.5-1 הרץ עבור תאי גליה ועד 2-10 הרץ עבור תאי עצב מכיוון שגליה Ca²⁺ התגובות אינן מהירות כמו Ca²⁺ ארעיים בנוירונים.
5. התחל את הניסוי וקבע פעילות בסיסית למשך 30 שניות.
6. החל תרופות מעניינות שחוממו מראש כגון אגוניסטים של קולטנים ואנטגוניסטים באמצעות מערכת הזלוף של זרימת הכבידה בקצב של 2-3 מ"ל לדקה. עקוב אחר מריחת אגוניסטים/אנטגוניסטים על ידי חזרה לזלוף של חיץ רגיל ואפשר תקופת שטיפה/התאוששות של לפחות 10 דקות.
   NOTE: זמני יישום התרופה ישתנו בהתאם לתרכובת הבודדת ולתכנון הניסוי. באופן כללי, יישום של 20-30 שניות של אגוניסט מספיק כדי להפעיל קולטנים מצומדים לחלבון G בתאי עצב ותאי גליה. עם זאת, תעלות יונים מגודרות ליגנד (כגון קולטני אצטילכולין ניקוטיניים) דורשות זמני יישום של לא יותר מ-5-10 שניות. חשיפות משך זמן נוספות יגרמו לתעלות יונים מגודרות ליגנד להפחית את הרגישות במהירות. יש להפעיל אנטגוניסטים למשך כ-3-15 דקות כדי להבטיח חסימה מוחלטת של מסלולי הקולטנים. עם זאת, זוהי הכללה גסה והחוקרים צריכים תמיד לייעל כל תרופה ניסיונית בפרדיגמה הספציפית שלהם.
7. הפסק את ההקלטה וצפה בסרטון דולג זמן של הניסוי. בחר בקפידה אזורי עניין (ROI's) באמצעות תוכנת ניתוח התמונה המתאימה.
8. השתמש בתוכנה כדי לנרמל ולהשוות את עוצמת הפלואורסצנט של החזר ההשקעה מול הערך הפלואורסצנטי הבסיסי הראשוני שלה. שינויים בקרינה מנורמלת עומדים ביחס ישר לשינויים ב-[Ca²⁺].
   1. השתמש בשינוי של שיטה שתוארה קודם לכן באמצעות ΔF/F = ((F1− F0)/F0)ROI − ((F1− F0)/F0)background, כאשר F1 הוא הקרינה בכל נקודה נתונה ו-F0 הוא הקרינה הבסיסית, כדי לשפר את דיוק ההערכה. שינוי זה מסייע בהפחתת רעש משינויים פלואורסצנטיים בתכשירי רקמות המציגים תנועה של שכבת השריר המונחת בבסיס מקלעת המיאנטרית.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Fluo-4 AM dye	Invitrogen	F-14201
Glucose	Sigma	G8270
Insect pins	Fine Science Tools	minutien pins
iQ Live Cell Imaging Software	אנדור	Andor iQ3
אשלגן כלורי<	P3911
מגנזיום כלוריד	Sigma	M9272
נתרן כלורי<	S9888
נתרן דימימן פוספט	Sigma	S8282
נתרן ביקרבונט	Sigma	S6014
Neo sCMOS camera	Andor	Neo 5.5 sCMOS
Nicardipine	Sigma	N7510
paristaltic pump	Harvard Apparatus	Model 720
Pluronic F-127	Invitrogen	P3000MP
Probenecid	molecular בדיקות	P36400
Scopolamine	Sigma	S1013
Sutter Lambda DG-4	Sutter	DG-4
Sylgard	Dow Corning	184
בקר טמפרטורה	וורנר אינסטרומנטס	TC-344C

td style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;font-family:Roboto;font-weight:normal;overflow:overflow;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;white-space:normal;word-wrap:wrap-strategy:4;'>Sigmatd style='background-color:#ffffff;color:#1a202c;משפחת גופנים:Roboto;משקל גופן:רגיל;גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;רווח לבן:רגיל;גלישת מילים:break-word;אסטרטגיית גלישה:4;'>סיגמא