$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.
1. מילוי אסטרוציטים ביונטופורזיס
- בדוק את האלקטרודה.
- מניחים פרוסת מוח בעדינות לתוך צלחת תחתית זכוכית מלאה ב-0.1 M PBS בטמפרטורת החדר. החזיקו את הפרוסה במקומה בעזרת נבל פלטינה עם חוטי ניילון.
- ודא שהאלקטרודה מחוברת לכרךtagמקור והנח את האלקטרודה הקרקעית באמבטיה המכילה את פרוסת המוח.
- העבר את המטרה לאזור המוח המבוקש.
- הורד את האלקטרודה לתמיסה. מתחת לשדה הבהיר, העבר אותו למרכז שדה הראייה ובחן אותו בזהירות עם עדשת הטבילה במים פי 40 כדי להבטיח שהוא נראה צלול וללא פסולת או בועות. אם יש משהו שסותם את קצה האלקטרודה, החלף אותו בחדש.
הערה: סתימה היא דאגה לאלקטרודה של 200 MΩ. עם צנטריפוגה וסינון של תמיסת הצבע לפני כל ניסוי, זו לא אמורה להיות בעיה תכופה. עם זאת, מכיוון שקצה האלקטרודה קטן, רקמה עלולה לפעמים להיתקע בפתח. המחברים לא מצאו דרך למנוע זאת, אך ניתן להתמודד עם זה בקלות על ידי שימוש באלקטרודה חדשה. - מתחת לשדה הבהיר, הורד לאט את האלקטרודה לכיוון הפרוסה ועוצרת ממש מעל פני השטח.
- מלאו אסטרוציטים ביונטופורזה.
- זהה אסטרוציטים 40-50 מיקרומטר מתחת לפני השטח של הפרוסה עם ניגוד הפרעות דיפרנציאלי אינפרא אדום (IR-DIC). חפש תאים עם סומטה מוארכת בצורת אליפסה בקוטר של כ-10 מיקרומטר. לאחר בחירת אסטרוציט, העבירו אותו למרכז שדה הראייה.
הערה: תא טוב ליונטופורזיס יש גבולות ברורים ומוגדרים סביבו. אל תבחר תאים קרובים מדי לפני השטח של הפרוסה מכיוון שלא ניתן למלא אותם לחלוטין. נדרש קצת תרגול במשך כמה ימים כדי להיות מסוגל לזהות באופן שגרתי אסטרוציטים למילוי צבע. כתלות באזור המוח ששימש לניסוי, מספר האסטרוציטים עשוי להשתנות. זה עשוי להשפיע על הזמן הדרוש לזיהוי אסטרוציטים לפני המילוי. - הורד לאט את קצה האלקטרודה לתוך הפרוסה, מנווט דרך הרקמה, עד שהוא נמצא באותו מישור כמו גוף התא.
הערה: הזז את האלקטרודה לאט כדי למנוע נזק לרקמה. - ברגע שגוף התא של האסטרוציט נראה ומתואר, קדם לאט ובעדינות את האלקטרודה קדימה. הזז את האלקטרודה עד שהקצה חודר לסומה של התא. הזיזו את מוקד המטרה לאט למעלה ולמטה כדי לשים לב אם האלקטרודה נמצאת בתוך הסומה.
הערה: קצה האלקטרודה חייב להיות בתוך גוף התא, ויש להבחין בשקע קטן על הסומה. אל תזיז את האלקטרודה עוד כדי למנוע מהקצה לעבור דרך התא. - ברגע שקצה האלקטרודה נמצא בתוך התא, הפעל את הסטימולטור ב-~0.5-1 וולט והוציא זרם ברציפות לתוך התא. בעזרת המיקרוסקופ הקונפוקלי, צפו במילוי התאים. הגדל את הזום הדיגיטלי כדי לראות את פרטי התא וודא שקצה האלקטרודה נראה בתוך התא.
הערה: הנמיכו את המתח אם נראה שצבע דולף מהתא או ממלא תאים אחרים בסביבה. אם נראה שצבע עדיין דולף החוצה מהתא, משוך את האלקטרודה החוצה לאט ומצא תא אחר. חשוב שהצבע לא ידלוף כדי שיהיה יחס אות/רקע גבוה בתמונה הסופית. - המתן כרבע שעה עד שהענפים והתהליכים העדינים יותר יופיעו מוגדרים, כבה את המתח ומשוך בעדינות את קצה האלקטרודה מהתא.
- דמיין את התא המלא.
הערה: ניתן לבצע הדמיה מיד לאחר המילוי. מטרה עם צמצם מספרי גבוה יותר (NA) מביאה לרזולוציה טובה יותר. - המתן עד שהתא יחזור לצורתו המקורית לפני הדמיה (15-20 דקות) עם מטרה של פי 40. כדי לדמות את התא, התאם את ההגדרה על הקונפקל כדי לוודא שהענפים והתהליכים העדינים יותר נראים מוגדרים.
- הגדר מחסנית z בגודל צעד של 0.3 מיקרומטר. בזמן ההדמיה, הזיזו את המטרה עד שאין אות מהתא והגדירו אותה כחלק העליון. לאחר מכן, הזז את המטרה כלפי מטה (התמקדות דרך התא) עד שאין אות, הגדר את זה כתחתית.