} סרטון זה מדגים את ההליך להטמעת המוח }{{}}} במטריצת פיברין, ואחריו הדמיה פלואורסצנטית בהילוך מהיר של תאי עצב בשעון הביולוגי כדי לנתח פעילות קצבית המסונכרנת עם מחזורי אור/חושך.
מאמר שיטה
הטמעת מוח דרוזופילה במטריצה להדמיית זמן-lapse של נוירוני השעון הביולוגי
711 צפיות
⸱
29 במאי 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
- הטמעה של צמחי מוח במטריצה תלת מימדית והרכבה (~20 דקות).
- טבלו מוח מנותח בתמיסת עבודה של פיברינוגן (ריכוז סופי של פיברינוגן ~3.3 מ"ג/מ"ל, 10.5 מיקרוליטר למוח) באופן הבא:
- שאפו 3.5 מיקרוליטר של מדיום פעיל שניידר (SAM)/אנטיביוטיקה. שאפו מוח מנותח היטב מהדיסקציה לאותו קצה פיפטה מבלי להוציא את מדיום ה-SAM/אנטיביוטיקה בקצה.
- הוציאו את המוח והמדיום על מכסה צלחת פטרי סטרילית. הוסיפו עוד 3.5 מיקרוליטר של SAM/אנטיביוטיקה ו-3.5 מיקרוליטר של תמיסת פיברינוגן/SAM חמה 10 מ"ג/מ"ל לטיפה המכילה את המוח. ערבבו בעדינות את התמיסה סביב המוח על ידי פיפטה עם קצה פיפטה של 20 מיקרוליטר.
הערה: שימוש בפיפטה במקום במלקחיים בשלב זה מונע לחץ על המוח. - קח 2 מיקרוליטר מתמיסת העבודה של הפיברינוגן מהטיפה והחל אותה כעיגול קטן על הכיסוי של צלחת תחתית הזכוכית. מוסיפים 0.8 מיקרוליטר תרומבין ומערבבים מהר מאוד עם קצה פיפטה. הפיברינוגן מומר לפיברין ומתחיל להתפלמר.
- קחו את המוח שיושב בתמיסת העבודה של הפיברינוגן (שלב 1.1) בין זוג מלקחיים ומקמו אותו על המטריצה ברגע שמטריצה לבנה של פיברין נראית לעין. כוון את המוח את הצד הקדמי כלפי מטה (עבור הדמיית נוירונים של שעון). דחוף אותו כלפי מטה קרוב ככל האפשר לזכוכית הכיסוי. קריש הפיברין מורכב משכבות של פיברין. בחרו שכבה אחת וקפלו אותה על גבי המוח בתנועות קטנות ועדינות מבלי לנתק את המטריצה.
- חזור על הפעולה 2 עד 3 פעמים מחלקים שונים של הקריש כדי לייצב את המוח.
הערה: כאשר מטפלים במוח עם מלקחיים, יש להיזהר לא לייבש אותו או להפעיל עליו לחץ פיזי.
- חזור על הפעולה 2 עד 3 פעמים מחלקים שונים של הקריש כדי לייצב את המוח.
- הוסיפו 20 מיקרוליטר של SAM/אנטיביוטיקה על גבי המוח המוטבע כדי לעצור את פעולת התרומבין.
- חזור על ההליך כדי להרכיב את המוחות הנותרים. ניתן להטמיע עד חמישה עד שישה מוחות בצלחת עם תחתית זכוכית.
- להדמיה חיה לטווח ארוך, הוסיפו 600 מיקרוליטר של SAM/אנטיביוטיקה לבאר הפנימית (חלק הזכוכית). מקם קרום פוליטטרפלואורואתילן (PTFE) חתוך מראש על גבי המדיום והדביק אותו לגריז הוואקום שנמרח על החלק הפלסטי של התחתית ( איור 1A).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| KH2PO4 | סיגמא-אולדריץ' | אני לא בטוח שהם בדיוק אותם אלה שיש לנו במעבדה. בחרתי "מתאים לתרבית תאי חרקים" בכל פעם שזמין | |
| CaCl2 | C7902 | ||
| MgSO4.7H2O | 230391 | ||
| NaCl | S5886 | ||
| NaHCO3 | סיגמא-אולדריץ' | S5761 | |
| D-(+) Glucose< | |||
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | Y1000 | |
| Insulin | |||
| Penicillin-Streptomycin | |||
| BIS-TRIS | Sigma-Aldrich | ||
| L-(−)-חומצה מאלית | M7397 | ||
| D-(+)-Trehalose dihydrate | T0167 | ||
| succinic acid | S9512 | ||
| חומצה פומרית | F8509 | ||
| α-Ketoglutaric acid | K1128 | ||
| non-heat-inactivated, סרום עגל עוברי (FCS) מיקופלזמה ווירוסים מוקרנים | 2-01F30-I | ||
| HEPES-KOH, pH 7.4 | |||
| KCl | |||
| NaH2PO4 | סיגמא-אולדריץ' | ||
| S7903 | |||
| fibrinogen מפלזמת בקר | אזהרה: מזיק בשאיפה, במגע עם העור ובמקרה של בליעה. מניפולציה תחת זרימה למינרית | ||
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T9549 | |
| PDF, NH2-NSELINSLLSLPKNMNDA-OH | Chi Scientific | ||
| Vaccum grease | Sigma-Aldrich | 18405 | |
| 35 מ"מ צלחת, כיסוי מס' 1.5, קוטר זכוכית 20 מ"מ, לא מצופה | MatTek | P35G-1.5-20-C | |
| Corning Falcon Easy-Grip Tissue Culture Girls | |||
| סטרילי 500 מ"ל Steritop-GP 33 מ"מ מסנן עליון של בקבוק הברגה, 0.22 מיקרומטר | |||
| סרט Polytetrafluoroethylene (PTFE) | Dupont | 200A טפלון FEP Film | |
| Millex-HV יחידת מסנן מזרק, 0.45 מיקרומטר, PVDF, 33 מ"מ, גמא מעוקרת | |||
| millex-GV Filter Unit, 0.22 מיקרומטר, PVDF, 33 מ"מ, גמא מעוקרת | |||
| צלחת חיתוך זכוכית עם שלוש בארות | |||
| מלקחיים עדינים, גודל 5, Dumont | כלים מדעיים עדינים | 11254-20 | |
| סורק טנדם הפוך TCS SP5 מיקרוסקופ קונפוקלי, עם סורק תהודה וגלאי מכפיל צילום HyD | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| תא בקרת טמפרטורה | Life Imaging Services | מערכת בקרת הטמפרטורה CUBE & BOX, מעוצבת בהתאמה אישית | |
| בקר לחות במה עליונה | מותאם אישית | ||
| Water Immersion Micro Dispenser: מתקן, סדרת מיקרו-משאבה מורחבת MP6 ותוכנת בקר אובייקטיבי של טבילה אוטומטית | Leica microsystem CMS GmbH | ||
| תוסף סחיפה ליצירת מחסנית SUM ותיקון תלת-ממד | |||
| 10x deconvolution איטרטיבי | AutoQuant ו-Imaris software |
הדפסות חוזרות והרשאות
בקש הרשאה לשימוש חוזר בטקסט או באיורים של מאמר JoVE זה
בקש הרשאה