הדמיה של זרם סידן בנוירונים במוח התיכון הגחוני שמקורם בעוברי עכברים

תקציר

מקור: } בנקרופט, א.א., . כימות Ca ספונטני²⁺{{}} שטפים והשפעותיהם במורד הזרם בתאי עצב ראשוניים במוח התיכון של עכבר. J. Vis. exp. (2020)
{{}}

{{TAG_ 46}}סרטון זה מדגים את ההדמיה בזמן אמת של זרימת סידן בתאי עצב גחוניים במוח התיכון שמקורם בעוברי עכברים. באמצעות וקטור ויראלי כדי לבטא אינדיקטור סידן, הנוירונים מצולמים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לעקוב אחר שינויים בעוצמת הקרינה במהלך פעילות סידן ספונטנית ומושרה על ידי נוירוטרנסמיטרים.

פרוטוקול

1. ציפוי התאים

הערה: בהתבסס על ניסיון, נאספים כ-100,000 תאים ברי קיימא לכל עובר. לעכברים בהריון מתוזמן בני 2-3 חודשים יש בדרך כלל גודל המלטה של 8-10 עוברים; לכן, הערכה גסה לתפוקה הכוללת של תאים לעכבר בהריון מתוזמן היא כמיליון תאים.

1. באמצעות המוציטומטר, בצע ספירת תאים ולאחר מכן דלל את התרחיף ל-2,000 תאים/מיקרוליטר באמצעות מדיום תרבית תאים. טריטורט קצר לערבב.
2. הסר את הכיסויים עם תמיסת למינין מהחממה ושאף את תמיסת הלמינין שנותרה מהכיסויים המצופים באמצעות ואקום. צלחת במהירות כדי למנוע מהכיסויים להתייבש לחלוטין. פיפטה 100 מיקרוליטר (2.0 x 10⁵ תאים/כיסוי) על כל כיסוי והנח צלחות פטרי באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
3. הוסיפו בזהירות 3 מ"ל של מדיום תרבית תאים לכל מנה והחזירו לחממה של 37 מעלות צלזיוס. Preform חצי בינוני משתנה פעמיים בשבוע למשך שבועיים.

2. זיהום של תרבית תאים ב-14 (ימים במבחנה) DIV עם וקטורים ויראליים

1. הקשורים לאדנו-(AAV) לכל מנה הכינו 1 מ"ל של מדיום DMEM ללא סרום עם 1 מיקרוליטר של hSyn-GCaMP6f AAV (1.0 x^{10 13} טיטר)
2. שאפו את מדיום תרבית התאים מכל צלחת והחליפו ב-1 מ"ל של מדיום הנשר המותאם (DMEM) של Dulbecco ללא סרום המכיל hSyn-GCaMP6f. החזירו את הכלים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה.
3. שאפו את המדיום נטול הסרום המכיל AAVs והחליפו ב-3 מ"ל של מדיום תרבית תאים. החזירו את הכלים לאינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. מצאנו ש-5-7 ימים של זיהום AAV מאפשרים רמות אידיאליות של ביטוי GCaMP. המשך להחליף את המדיום כל 2-3 ימים לאורך תקופה זו של זיהום ויראלי.

3. הדמיה חיה קונפוקלית Ca²⁺ בין 19-21 ימים במבחנה (DIV)

הערה: הדמיה יכולה להתבצע בין 5-7 ימים לאחר הדבקה ויראלית. זהו החלון האידיאלי להשגת ביטוי גלוי של הפלואורופור ברמות המאפשרות זיהוי של פעילות Ca²⁺ ספונטנית.

1. הכנת מאגרי הקלטה
   1. כדי ליצור 1 ליטר של מאגר הקלטה HEPES, הוסף: 9.009 גרם NaCl, 0.3728 גרם KCl, 0.901 גרם D-גלוקוז, 2.381 גרם 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES), 2 מ"ל של תמיסת מלאי 1 M CaCl₂, ו-500 מיקרוליטר של 1 M MgCl₂ תמיסת מלאי ל-800 מ"ל של H₂ מזוקק סטריליO. הביאו את ה-pH ל-7.4 עם NaOH. מביאים לנפח סופי של 1 ליטר.
   2. כדי ליצור 200 מ"ל של מאגר הקלטת גלוטמט של 20 מיקרומטר, יש לדלל 40 מיקרוליטר של תמיסת מלאי גלוטמט של 100 מ"מ ל-200 מ"ל של מאגר הקלטה HEPES שתואר לעיל.
2. הדמיה
   1. קונפוקליתמלא צלחת פטרי סטרילית 35 מ"מ עם 3 מ"ל של מאגר הקלטה.
   2. הסר צלחת פטרי 35 מ"מ עם תרביות נגועות מהחממה של 37 מעלות צלזיוס. בעזרת מלקחיים עדינים יש לתפוס בזהירות את הקצה של כיסוי אחד ולהעביר אותו במהירות לתוך צלחת הפטרי המלאה במאגר הקלטה. הנח את הכיסוי הנותר באמצע בחזרה לתוך החממה של 37 מעלות צלזיוס. העבר את המנה עם מאגר ההקלטה למיקרוסקופ הקונפוקלי.
   3. הפעל את תוכנת ההדמיה. המשך לשלב הבא בזמן האתחול.
   4. הפעל את המשאבה הפריסטלטית והנח את הקו במאגר ההקלטה. כייל את מהירות הזרימה ל-2 מ"ל/דקה.
   5. העבר את הכיסוי הנגוע מצלחת פטרי 35 מ"מ לאמבט ההקלטה.
   6. באמצעות מטרת הטבילה במים פי 10 ואור השדה הבהיר (BF), מצא את מישור המיקוד וחפש אזור עם צפיפות גבוהה של גופי תאי עצב. עבור למטרת הטבילה במים פי 40 והשתמש באור BF כדי למקד מחדש את הדגימה.
   7. בחלון "רשימת צבעים" בתוך FluoView בחר AlexaFluor 488 והחל אותו.
   8. AAV יכולים להיות משתנים; לכן, על מנת למנוע חשיפת יתר והלבנת פוטו של הפלואורופורים, התחל עם הגדרות HV ולייזר נמוכות. עבור ערוץ AlexaFluor 488, הגדר את המתח הגבוה (HV) ל-500, את הרווח ל-1x והיסט ל-0. עבור קו הלייזר 488 הגדר את ההספק ל -5%. כדי להגדיל את הנפח האפקטיבי המצולם במישור z, הגדל את גודל חור הסיכה ל-300 מיקרומטר. השתמש באפשרות הסריקה "פוקוס x2" כדי להתאים בצורה אופטימלית את אותות הפליטה לרמות תת-רוויה. מכאן ניתן לכוונן את ההגדרות עד להשגת נראות אידיאלית של כל ערוץ.
      הערה: כדי ללכוד במדויק את הטווח המלא של שטפי Ca²⁺ עם GCaMP, התאם את הגדרות ה-HV והספק הלייזר הבסיסיות כדי לאפשר עלייה בעוצמת הפלואורסצנט מבלי להרוות יתר על המידה את הגלאי.
   9. לאחר אופטימיזציה של הגדרות המיקרוסקופ, העבר את השלב כדי לאתר אזור עם מספר תאים המציגים שינויים ספונטניים בקרינה GCaMP6f והתמקד במישור הרצוי להדמיה.
   10. השתמש בכלי "Clip rect" כדי לחתוך את מסגרת ההדמיה לגודל שיכול להשיג מרווח פריימים של קצת פחות משנייה אחת. זה הכרחי כדי להגדיר את מרווח ההדמיה לפריים אחד לשנייה.
   11. הגדר את חלון "מרווח" לערך של 1.0 ואת החלון "Num" ל-600.
       הערה: על מנת לספק מאגרי הקלטה שונים בנקודת הזמן הרצויה (300 שניות), חשוב לכייל את זמן ההשהיה של המשאבה כדי לספק את הפתרון החדש לאמבטיה. זה יהיה תלוי בקצב הזלוף של התמיסה (2 מ"ל לדקה) ובאורך הקו המשמש לשאיבת תמיסה.
   12. כדי לצלם סרט מסדרת t, בחר באפשרות "זמן" ולאחר מכן השתמש באפשרות הסריקה "XYt" כדי להתחיל בהדמיה.
   13. צפה בסרגל התקדמות ההדמיה והעבר את הקו ממאגר ההקלטה HEPES למאגר הקלטת הגלוטמט של 20 מיקרומטר בנקודת הזמן המתאימה (למשל, אם חביון המשאבה מכויל לספק תמיסה ב-60 שניות, העבר את הקו למאגר הגלוטמט ב-240 פריימים על מנת לספק גלוטמט ב-300 שניות).
   14. בסיום ההדמיה, בחר בלחצן Series Done ושמור את הסרט המוגמר מסדרת t. המשך להחדיר 20 מיקרומטר גלוטמט למשך 5 דקות נוספות, כך שהנוירונים המתורבתים נחשפו לגלוטמט למשך 10 דקות בסך הכל. חזור על תהליך זה עבור כל כיסוי להדמיה.
   15. לאחר החשיפה הנוספת של 5 דקות ל-20 מיקרומטר גלוטמט, הסר את הכיסוי מהאמבטיה והנח בחזרה לצלחת פטרי 35 מ"מ המכילה מאגר הקלטה עד להשלמת יום ההדמיה.

חומרים