הדמיית סידן במבחנה בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך

תקציר

מקור: Calvo-Rodríguez, et al. דימות פלואורסצנטי וביו-לומינסנציה של Ca תת-תאי²⁺ בנוירונים היפוקמפוס מזדקנים. J. Vis. exp.} (2015).

סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיה פלואורסצנטית למדידת רמות סידן ציטוזולי בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך. על ידי השוואה בין נוירונים צעירים ומבוגרים, הוא מדגיש כיצד צפיפות מוגברת של תעלות סידן מגודרות מתח מסוג L והפעלה ממושכת בתאי עצב מזדקנים גורמים לעומס יתר של סידן, סימן היכר של הזדקנות עצבית. אינדיקטורים לסידן פלואורסצנטי חושפים את ההבדלים הללו באמצעות שינויים בעוצמת הקרינה בעת הגירוי.

פרוטוקול

1. תרבות לטווח קצר וארוך של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות

1. הכנת כיסויי זכוכית מצופים פולי-D-ליזין, 12 מ"מ.
   1. עקר כיסויי זכוכית בקוטר 12 מ"מ באתנול למשך 24 שעות לפחות. הניחו להם להתייבש בתנאים סטריליים.
   2. מחלקים את הכיסויים על רצועת פרפילם בצלחת פטרי. מכסים את פני השטח של כל כיסוי ב-200 מיקרוליטר של 1 מ"ג/מ"ל פולי-D-ליזין. יש לאפשר טיפול למשך הלילה (O/N).
   3. למחרת שטפו את הכיסויים במים סטריליים מזוקקים כפולים כל 15 דקות למשך 90 דקות בתנאים סטריליים.
   4. מלאו צלחת מרובת בארות עם 500 מיקרוליטר של מדיום תרבית נוירובזאלית לבאר. יש להוסיף ל-Neurobasal Culture Medium 10% סרום בקר עוברי, 2% B27, 1 מיקרוגרם/מ"ל גנטמיצין ו-2 מ"מ L-גלוטמין.
   5. הנח את הכיסויים על הצלחת הרב-תכליתית. שמור אותם בלחות של 37 מעלות צלזיוס ו<5% COspan style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂ incubator עד השימוש.
2. בידוד נוירונים בהיפוקמפוס מחולדות יילודים.
   1. הכינו תמיסת פפאין של 1.8 מ"ל (נרכשת ישירות) בבקבוקון (20 מיקרוליטר/מ"ל) בתנאים סטריליים: כדי להשיג ריכוז סופי של 20 מיקרוליטר/מ"ל הוסיפו כ-40 מיקרוליטר פפאין ב-1.8 מ"ל האנק בתוספת 0.6% אלבומין בסרום בקר (יש לחשב BSA, מיקרוליטר בהתאם לתנאי הספק). 0.6% BSA של האנק מוכן על ידי ערבוב של 85 מ"ל של מדיום תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של הנקס עם 15 מ"ל של אלבומין בסרום בקר 4% (BSA, מוכן לתמיסת 4 גרם BSA ב-100 מ"ל HBSS). הכינו אותו במכסה מנוע סטרילי.
   2. יש לדגור את הפפאין ב-Hank's plus 0.6% BSA למשך 30 דקות ב-37 מעלות צלזיוס לפני השימוש. סנן את התמיסה באמצעות מסנן 0.22 מיקרומטר לפני השימוש.
   3. הכינו את מדיום ה-F-12 של Ham's על ידי הוספת אבקת Dubbecco's Modified Eagle's Medium (13.5 גרם לליטר) ב-900 מ"ל מים סטריליים מזוקקים כפולים. לאחר מכן הוסף 6 גרם 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) ו-336 מ"ג NaHCO₃ והתאם את ה-pH ל-7.42 באמצעות NaOH 4 N. הוסף מים סטריליים לקבלת תמיסה של 1 ליטר וסנן אותם באמצעות מסנן עליון של בקבוק פוליאתרסולפון (PES) של 0.20 מיקרומטר. נשא את התהליך הזה במכסה מנוע סטרילי. לבסוף יש להרוות את הפתרון ב-CO₂ בתנאים סטריליים לפני השימוש. אחסן פתרונות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס והשתמש בהם צוננים.
   4. המתת חסד של גורי חולדות שזה עתה נולדו (P0) על ידי עריפת ראש ושטיפה של הראש במדיום HBS סטרילי. פתח את הגולגולת בעזרת מספריים סטריליים. חלץ את המוח בעזרת מרית ושטוף אותו במהירות במדיום F-12 של Ham.
   5. בצע חיתוך אלכסוני בעזרת אזמל בכל חצי כדור (איור 1B) ולשאת אותו לצלחת פטרי המכילה את מדיום ה-F-12 של האם.
   6. השליכו את קרומי המוח בזהירות בעזרת מלקחיים לדיסקציה ותחת זכוכית מגדלת.
   7. זהה את ההיפוקמפוס במיקום קעור אופייני מעל קליפת המוח באמצעות זכוכית מגדלת. לאחר מכן, הפרידו את ההיפוקמפוס מקליפת המוח על ידי משיכה בזהירות מגבול אחד והסרתו ממקומו באמצעות מספריים לעיניים.
   8. העבר את רקמת ההיפוקמפוס לצלחת בת 4 בארות מלאה במדיום סטרילי של האנק חסר Ca²⁺ ו-Mg²⁺ בתוספת 0.6% BSA ושטיפת רקמת ההיפוקמפוס. מבלי להסיר את המדיה, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות (בסביבות 2X2 מ"מ) בעזרת אותם מספריים לעיניים.
   9. העבירו חתיכות היפוקמפוס לבקבוקון המכיל 1.8 מ"ל תמיסת פפאין מסוננת מראש. לאחר מכן דגרו אותם בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור עדין מדי פעם. 15 דקות לאחר מכן, הוסיפו 90 מיקרוליטר של תמיסת DNase I (50 מיקרוגרם/מ"ל סופי) ודגרו למשך 15 דקות נוספות.
   10. העבירו את הרקמה לצינור צנטריפוגה של 10 מ"ל ושטפו את השברים עם מדיום תרבית נוירובזאלי טרי. השג תרחיף תאים על ידי העברת שברי רקמות דרך פיפטה מפלסטיק של 5 מ"ל.
   11. תרחיף תאי צנטריפוגה ב-160 x גרם למשך 5 דקות. הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה פסטר סטרילית מפלסטיק ותלה את הגלולה בזהירות עם פיפטה אוטומטית של 1 מ"ל ב-1 מ"ל של מדיום תרבית נוירובזאלית.
   12. מדוד את צפיפות התאים באמצעות תא ספירה של נויבאואר. הנח את כיסוי הזכוכית מעל תא נויבאואר. הוסף 10 מיקרוליטר של תרחיף תאים. ודא שמתלה התא נכנס לתא בצורה אחידה ואינו יוצר בועות. ספור את מספר התאים מתחת למיקרוסקופ ובצע חישובים מתאימים כדי לקבל טיפה מתאימה של 40-80 מיקרוליטר המכילה 30 x 10³ תאים. המספר הכולל של התאים יהיה תלוי במספר בעלי החיים המשמשים.
3. תרבית לטווח קצר וארוך של נוירונים בהיפוקמפוס של חולדות.
   1. מעל הצלחת מרובת הבארות המכילה 500 מיקרוליטר של Neurobasal Culture Medium שהוכן לפני ונשמר בחממה, צלחת בסביבות 30 x 10³ תאים בטיפה של כ-50 מיקרוליטר לכל באר של הלוח הרב-צליתי המכיל כיסוי זכוכית אחד מצופה פולי-D-ליזין, בקוטר 12 מ"מ.
   2. שמור על תאי היפוקמפוס ראשוניים בלחות של 37 מעלות צלזיוס ו<5% COspan style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>₂חממה למשך 2-5 ימים in vitro (DIV, תרבויות צעירות לטווח קצר) או >15 DIV (תרבויות ארוכות טווח, מיושנות) לפני ניסויים מבלי לשנות את מדיית התרבות.

2. הדמיה פלואורסצנטית של Ca ציטוזולי²⁺ ריכוז

1. הכנת פתרונות בדיקה להדמיה פלואורסצנטית.
   1. הכינו תמיסת מלח חיצונית עם HEPES-buffered (HBS) המכילה ב-mM: NaCl 145, KCl 5, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, גלוקוז 10, נתרן-HEPES 10 (pH 7.42).
   2. הכן סגנון חיצוני, Mg2+, תמיסת מלח עם מאגר HEPES (HBS) מכיל, במ"מ: NaCl 146, KCl 5, CaCl₂ 1, גלוקוז 10 ו-HEPES 10 (pH 7.42).
   3. פתור N-methyl-D-aspartate (NMDA) ב-Mg²⁺, תמיסת מלח חוצצת HEPES (HBS) בריכוז סופי של 100 מיקרומטר ומשלימה אותו עם 10 מיקרומטר גליצין.
   4. הכן פתרון HBS המכיל KCl במקום NaCl על ידי פתרון (ב-mM): KCl 145, MgCl₂ 1, CaCl₂ 1, גלוקוז 10 ו-HEPES 10 (pH 7.42).
2. העמסת תאי היפוקמפוס עם בדיקת סידן פלואורסצנטית fura2/AM.
   1. הסר את תרבית התאים המכילה כיסויים מהחממה ושטוף אותם עם מדיום HBS בטמפרטורת החדר (RT) על ידי העברתם לצלחת חדשה בעלת ארבע בארות המכילה 500 מיקרוליטר HBS לבאר.
   2. דגרו על תאים עם fura2/AM 4 מיקרומטר (מוכן באותו מדיום HBS) למשך 60 דקות ב-RT (25 מעלות צלזיוס) במקום חשוך.
   3. לאחר 60 דקות, שטפו את הכיסויים עם מדיום HBS טרי.
3. הקלטת תמונות פלואורסצנטיות של ציטוזולי [Ca²⁺] בתאים מתורבתים.
   1. הפעל את המנורה, המיקרוסקופ, מערכת הזילוף, מצלמת הקרינה והמחשב.
   2. הנח את הכיסויים בפלטפורמה תרמוסטטית לכיסויי זכוכית פתוחים של 12 מ"מ על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך ובחר שדה מיקרוסקופי באמצעות אובייקט 40X (שמן, צמצם מספרי [NA]:1.3). תאי החדרה ברציפות עם מדיום HBS מחומם מראש (37 מעלות צלזיוס) בהיעדר או נוכחות של חומרי בדיקה. שמור על הזרימה בקצב של כ-5-10 מ"ל לדקה.
      note: מערכת זלוף תאים לתאים חיים מותקנת בפלטפורמה תרמוסטטית לכיסויי זכוכית פתוחים בגודל 12 מ"מ. מערכת זלוף מונעת כוח משיכה בת 8 קווים המצוידת בבקר שסתומים משמשת להזרמת הפתרונות. משאבת ואקום אחראית על הסרת כל מדיום עודף. הפתרונות מחוממים באמצעות מערכת חימום בצינור.
   3. צלם תמונת רקע כשהתריס סגור בשני אורכי גל העירור.
   4. תאים מאירים לסירוגין ב-340 ו-380 ננומטר. הקלט אור הנפלט ב-520 ננומטר כל 5-10 שניות עם מצלמת פלואורסצנטיות, המסוננת על ידי מראה דיכרואית fura-2.
   5. בסיום תקופת ההקלטה, אחסן את הרצף המלא של התמונות הנפלטות ב-520 ננומטר במחשב להמשך ניתוח.
4. ניתוח תמונות פלואורסצנטיות מוקלטות.
   1. פתח את קובץ הניסוי. באמצעות תוכנת aquacosmos, לחץ על 'יחס' ובחר את טווח היחס הרצוי. חשב את היחס פיקסל לפיקסל בתמונות המתקבלות על מנת לקבל רצף של תמונות יחס.
   2. הפחת רקע על ידי התאמת 'מחיקת הרקע'. לחץ על 'התחל חישוב'.
   3. לחץ על כפתור 'רצף כל הזמנים' ומחק את אזורי העניין העתיקים (ROIs). לניתוח כמותי של תאים בודדים, קבע אזורי עניין חדשים או ROIs המתאימים לנוירונים בודדים. ממוצע של כל ערכי היחס בכל פיקסל המתאימים לכל החזר ROI ולכל תמונה כדי לקבל הקלטה של ערכי הקרינה ביחס עבור החזר ROI בודד (תאים).
   4. כדי לשרטט גרף של ההקלטות הבודדות, ייצא את ערכי הקרינה היחסיים המתאימים לכל החזר ROI לתוכנית גרפים.
   5. בצע את החישובים המתאימים להערכת גודל העליות ביחס הקרינה בתגובה לכל גירוי באמצעות תוכנת ניתוח נתונים וגרפים מתאימה.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Neurobasal Culture Medium	Gibco	21103-049
HBSS medium	Gibco	14170-088
Ham's F-12 medium	Gibco	31330-038
DNase I (מלבלב בקר)<	D5025-15KU
Fetal Bobine Serum	Lonza	DE14-801E
B27	Gibco	17504-044
Gentamicin	Gibco	15750
L-glutamine	Gibco	25030-032
12 מ"מ כיסויי זכוכית	Labolan	0111520/20012
Papain	Worthington	LS003127
4-well לוחות מרובים	Nunc	176740
כלי פטרי	JD Catalan s.l.	2120044T
פיפטות סטריליות	Fisher Scientific	431030
Fura2-AM	Life Technologies	F1201
Lipofectamine2000	Invitrogen	11668-027
NMDA	Sigma	M3262
Glycine	Sigma	50046
Zeiss Axiovert S100 TV microscope	Carl Zeiss Inc.
Xcite ilumination system	EXFO
ORCA ER fluorescence camera	Hamamatsu
בקר שסתומים VC-8	Warner Instruments
SH-27B חימום system	Warner Instruments
Aquacosmos Software	Hamamatsu Photonics

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma