הדמיית פלאק עמילואיד-בטא במקטעים של רקמת המוח על ידי תיוג חיסוני וצביעת כורכומין

תקציר

מקור: Maiti, P. et. al.,. תיוג והדמיה של פלאק עמילואיד ברקמת המוח באמצעות הפוליפנול כורכומין הטבעי. J. Vis. exp. (2019)

{{}}

סרטון זה מדגים את הליך ההדמיה של פלאק עמילואיד-בטא במקטעי רקמת המוח באמצעות תיוג חיסוני וצביעה של כורכומין. תיוג חיסוני מספק ספציפיות לעמילואיד-בטא, בעוד כורכומין קושר באופן סלקטיבי סיבים עשירים ב-β יריעות, ומשפר את ההדמיה. הלוקליזציה המשותפת של הקרינה האדומה והירוקה מאשרת את נוכחותם של פלאקים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

{{TAG_ 16}}1. זלוף של בעלי החיים

1. {{}}הכינו את מאגרי הקיבוע והזלוף.
   1. הכן 0.1 M מאגר נתרן פוספט על ידי הוספת 80 גרם נתרן כלורי (NaCl), 2 גרם אשלגן כלורי (KCl), 21.7 גרם דיסודיום מימן פוספט (Na₂HPO₄·7H₂O), 2.59 גרם של אשלגן דימימן פוספט (KH₂PO₄), ומים מזוקקים כפולים כדי ליצור סך של 1 ליטר.
   2. הכינו 4% פרפורמלדהיד (PFA).
      1. הוסף 40 גרם של פרפורמלדהיד ל-1 ליטר של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS) (0.1 M, pH 7.4).
      2. מחממים את תמיסת ה-PFA ל-60-65 מעלות צלזיוס ומערבבים באמצעות מערבל מגנטי.
         הערה: הטמפרטורה לא תעלה על 65 מעלות צלזיוס.
      3. הוסף כמה טיפות של נתרן הידרוקסיד (NaOH) (1 N) עם טפטפת כדי להמיס את ה-PFA לחלוטין.
      4. סנן את תמיסת ה-PFA בנייר סינון בינוני עד דק ואחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
         הערה: הפתרון תקף לחודש.
2. בצע הרדמה וזלוף של בעלי חיים.
   הערה: B6SJL-Tg APP SwFlLon, PSEN1*M146L*L286V, 1136799Vas/J ( מחלת אלצהיימר משפחתית 5x (5×FAD)) עכברי ביקורת תואמי גיל (n = 6 לקבוצה) נרכשו מספקים וגודלו בבית החיות של אוניברסיטת המדינה של עמק סגינאו. גנוטיפ אושר על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR). רקמת מוח אנושית מחלת אלצהיימר (AD) כוללת רקמת מוח לאחר המוות ורקמת בקרה תואמת גיל.
   1. יש להרדים את בעל החיים עם חומר הרדמה מתאים, כגון נתרן פנטוברביטל (390 מ"ג/ק"ג משקל גוף), או תערובת קטמין/קסילזין (עד 80 מ"ג/ק"ג קטמין משקל גוף ו-10 מ"ג/ק"ג משקל גוף קסילזין) על ידי הזרקה תוך-צפקית (מחט 27 גרם ומזרק 1 מ"ל). בדוק את רמת ההרדמה על ידי צביטה של הבוהן. אם החיה אינה מגיבה, היא מוכנה לניתוח זלוף.
   2. הנח את החיה המורדמת במצב שכיבה על מגש ניתוח הזלוף ובעזרת מספריים קשתית קטנות, בצע חתך בקצה האחורי של החדר השמאלי.
   3. הכנס מחט זלוף 22 גרם לחדר השמאלי ובצע חתך קטן באפרכסת הימנית כדי להסיר נוזל זלוף מהגוף. השתמש במערכת זלוף המוזנת בכוח הכבידה כדי לאפשר לנוזל הזלוף הקר כקרח (0.1 M PBS, pH 7.4) לזרום במשך 5-6 דקות (קצב זרימה 20-25 מ"ל/דקה).
      הערה: כבד צלול הוא האינדיקטור לזלוף אופטימלי.
   4. העבירו את שסתום החיץ לתמיסת פרפורמלדהיד 4% קרה כקרח לקיבוע ואפשרו לו לזרום במשך 8-10 דקות.
      הערה: רעד ואחריו גפיים קשות או נוקשות הוא אינדיקטור לקיבוע טוב.
   5. הסר את המוח מהגולגולת באמצעות מספריים. בעזרת מרית, אספו את המוח והניחו אותו בבקבוקון של 4% PFA (לפחות פי 10 מנפח המוח) ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש נוסף.

2. עיבוד רקמות

1. {{}} קטעי קריוסטט.
   1. העבירו את המוח לתמיסות סוכרוז מדורגות (10%, 20% ו-30%) ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות כל אחת, עד לשימוש.
   2. בעזרת קריוסטט בטמפרטורה של -22 מעלות צלזיוס, חותכים חלקים בעובי 40 מיקרומטר. אוספים 10-20 חלקים לבאר בצלחת של 6 בארות מלאה ב-PBS ונתרן אזיד (0.02%).

3. למקם את cur(curcumin) עם נוגדן Aβ בפלאק Aβ ובאוליגומרים.

1. שטפו קטעי קריוסטט משלב 2.1.2 עם PBS 3x בצלחת של 12 בארות.
2. חסום את החלקים עם 10% סרום עיזים רגיל (NGS) מומס ב-PBS עם 0.5% Triton-X-100 בטמפרטורת החדר למשך שעה.
3. השליך את פתרון החסימה. דגרו את החלקים עם נוגדנים ספציפיים לעמילואיד-בטא (Aβ) (6E10 או A11, מדולל 1:200) מומסים בתמיסת חסימה טרייה המכילה 10% NGS ו-0.5% Triton-X100 למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס בשייקר ב-150 סל"ד.
4. השליכו את תמיסת הנוגדנים ושטפו את החלקים עם PBS 3x למשך 10 דקות כל אחד.
5. דגירה עם תג הנוגדן המשני עם פלואורופור אדום (למשל, Alexa
6. 594) למשך שעה בטמפרטורת החדר בחושך.
7. שטפו עם PBS 3x למשך 10 דקות כל אחד.
8. שטפו עם 70% אלכוהול 1x.
9. דגרו את החלקים עם כורכומין (Cur (10 מיקרומטר)) למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
10. שוטפים עם 70% אלכוהול 3x למשך דקה אחת כל אחד.
11. יש לייבש עם 90% ו-100% אלכוהול למשך דקה אחת כל אחד, לנקות עם קסילן פעמיים למשך 5 דקות כל אחד, ולהרכיב על שקופיות באמצעות דיסטירן פלסטירייזר קסילן (DPX).
12. דמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם מסנני עירור/פליטה מתאימים לאותות האדומים והירוקים.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
aanimal model of alzheimer's	המעבדה של ג'קסון, בר הרבור, ME
אלכוהול מוחלט	VWR,Radnor, PA
Alexa 594	Santacruz Biotech, Dallas, TX<
נוגדן 6E10	Biolegend, סן דייגו, קליפורניה
נוגדן A11	Millipore, Burlington, MA
Cryostat	GMI, רמזי, מינסוטה	LeicaCM1800
Curcumin	Sigma, סנט לואיס, מיזורי
דיסודיום מימן פוספט	סיגמא, סנט לואיס, MO
פלסטיק דיסטירן קסילן	BDH, Dawsonville, GA
Filter papers	פישר סיינטיפיק, פיטסבורג, פנסילבניה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך	Leica, Buffalo Grove, IL	Leica DMI 6000B
inverse fluorescent microscope הפוך	אולימפוס, שינג'וקו, יפן	Olympus 1x70
סרום עז רגיל	סיגמא, סנט לואיס, MO
Paraformaldehyde	סיגמא, סנט לואיס, MO
אשלגן כלורי	סיגמא, סנט לואיס, MO
אשלגן דימימן פוספט	סיגמא, סנט לואיס, MO
נתרן אזיד	סיגמא, סנט לואיס, MO
נתרן כלורי<
נתרן הידרוקסיד	EMD Millipore, Burlington, MA
נתרן פנטוברביטל	Vortex Pharmaceuticals limited, Dearborn, MI
Triton-X-100	סיגמא, סנט לואיס, MO
Xylene	VWR,Radnor, PA

diseasetd style='background-color:#ffffff;overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'> td style='צבע רקע:#ffffff;צבע:#1a202c;משפחת גופנים:Arial;גודל גופן:10pt;משקל גופן:רגיל;גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;רווח לבן:רגיל;גלישת מילים:שבירת מילה;אסטרטגיית גלישה:4;'>סיגמא, סנט לואיס, MO