הדמיית חלבון קינאז פעילות בעכבר באמצעות מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטי דו-פוטוני

תקציר

מקור: Jongbloets, B. C., et al. הדמיית חלבון קינאז פעילות בעכברים המתנהגים קבועים בראש באמצעות מיקרוסקופ הדמיה פלואורסצנטי דו-פוטוני in vivo. J. Vis. Exp. (2019)
}

סרטון זה מדגים הליך מיקרוסקופ הדמיה לכל החיים של פלואורסצנטי דו-פוטוני להדמיית פעילות חלבון קינאז A בעכברים קבועי ראש ומתנהגים במהלך תנועה כפויה.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. In Vivo מיקרוסקופיה הדמיה לכל החיים של פלואורסצנציה דו-פוטונית

1. התחל הדמיית מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של שני פוטונים (2pFLIM) בשבועיים לאחר התקנת חלון הגולגולת. צמצם את ההפרעות הניסויות עקב מתח על ידי טיפול תכוף וקשקוש של העכבר לפני תחילת מחקר ההדמיה כדי להרגיל את העכבר.
2. הגדר את אורך הגל של לייזר עירור שני פוטונים ל-960 ננומטר באמצעות התוכנה השולטת בלייזר דו-פוטוני.
3. הרדמו את העכבר באמצעות איזופלורן 4%. ודא הרדמה נכונה על ידי צביטת זנב והתבוננות בקצב הנשימה. כלומר, לא אמורה להיות תגובה לצביטת הזנב ויש להפחית את קצב הנשימה ל~1 נשימה בשנייה. כדי למזער זמן פרוצדורלי מיותר ומכיוון שההרדמה נמשכת רק שתיים-שלוש דקות, לא משתמשים בחומרי סיכה לעיניים.
4. העבר את העכבר המורדם להליכון הממונע (איור 1C) והתקן את לוחית הראש של העכבר למחזיק לוחית הראש של מערך ההליכון (ראה איור 1 לפרטים). נקה את פני השטח של כיסוי חלון הגולגולתהחלקה על העכבר עם 70% אתנול.
5. הנח את ההליכון הממונע עם העכבר המותקן מתחת למטרה 2pFLIM. מרחו טיפת מים מזוקקים בין כיסוי חלון הגולגולת למטרה.
6. תן לעכבר הרכוב להתעורר מההרדמה ולהתאקלם בסביבת ההליכון והמיקרוסקופ למשך 10 דקות לפחות. עקוב אחר קצב הנשימה של העכבר בזמן שהעכבר המותקן מתעורר מהרדמה.
7. נווט למיקום ההזרקה תחת אפי-תאורה. תעד מאפיינים נאמנים (כלומר, כלי דם) תחת שדה בהיר כדי לסייע בהדמיה של אותו אזור עניין (ROI) במהלך מפגשי הדמיה עוקבים.
8. הסר כל אור נכנס מלבד האור הנפלט מרקמת המוח. כבה את מקור האור epi-illumination וסגור את המארז של מתקן 2pFLIM. הפעל את 2pFLIM PMT על ידי הפעלת בקרת מתח פקודת החומרה.
9. רכוש תמונת z-stack 2pFLIM באמצעות תוכנת הרכישה 2pFLIM FLIMimage עם ההגדרות המומלצות הבאות להדמיית סומטה חיובית tAKARα בעכברים ערים. הגדר את ממוצע הפריימים ל-3 פריימים, מהירות הסריקה ל-2 אלפיות השנייה לשורה, גודל התמונה ל-128 x 128 פיקסלים ושדה הראייה ל-90-100 מיקרומטר. התאם את הגדרות ההדמיה בהתבסס על ההכנה ותצורת החומרה.
10. בדוק את התמונה הנרכשת בתצוגת FLIM (תוכנה מותאמת אישית שפותחה בבית). התאם את הגדרות ההדמיה לפי שלב 1.9 כדי לייעל את ספירת הפוטונים ולמזער את ההלבנה.

הערה: ספירת פוטונים משולבת מעשית ב-ROI עבור הדמיה לכל החיים של סומה tAKARα-חיובית in vivo היא ~1,000-10,000 פוטונים בהתאם למשרעת האות הנובעת מגירוי מסוים.

1. השתמש בשדה ראייה מופחת, ירידה במהירות הסריקה, הגדלת עוצמת הלייזר והגדלת מספר הפריימים שיש לחשב בממוצע כדי להגדיל את ספירת הפוטונים המשולבים ולהפחית את שגיאת הערכת אורך החיים. יחד עם זאת, הקפד להשתמש בעוצמת הלייזר החיונית המינימלית, ממוצע המסגרת ומהירות הסריקה כדי למזער את ההלבנה.
2. תמונה במרווח זמן קבוע (למשל, כל 30-60 שניות) על ידי חזרה על רכישת z-stack באמצעות הגדרות שנקבעו בשלב 1.10. רכוש תמונות בסיסיות של 2pFLIM למשך 15 דקות לפחות במהירות הליכון אפסית.
3. הגדר את מהירות סיבוב ההליכון ל-~15 ס"מ לשנייה למשך 15 דקות תוך רכישת תמונות 2pFLIM. המשך בהדמיה במשך ≥20 דקות לאחר כיבוי סיבוב ההליכון, כדי להעריך את משך פעילות ה-PKA לאחר הפסקת התנועה הכפויה.
   

2. ניתוח של תמונות 2pFLIM

1. פתח את התמונות שנרכשו ב-FLIMview והגדר את הפרמטרים הבאים ב-FLIMview.

1. לחץ על שדות הטווח המינימלי והמקסימלי של ספירת פוטונים בודדים (SPC) ב-FLIMview. הזן את ערך טווח ה- SPC המינימלי והמקסימלי המתאים, בדרך כלל נע בין 1.2−2 ל- 10−12 ns, בהתאמה.

2. לחץ על t₀ שדה הערך ב-FLIMview והזן את שדה הערכים₀ (בדרך כלל ~2 ns). לחץ על שדה ערך הסף המינימלי של בהירות לכל החיים ב-FLIMview והזן את ערך הסף הרצוי ל-5-30 פוטונים.

2. לחץ על כפתור הקבוצה החדשה (N) והקצה שם קבוצת ניסוי. פעולה זו תיצור קבוצה המשלבת נתונים מכל תמונת FLIM שנוספה.

3. לחץ על ROI כפתור בלחצן Roi Controls של FLIMview וצייר החזר ROI סביב סומה חיובית ל-tAKARα. צמצם את טווח z-stack על-ידי הזזת גבול z התחתון והעליון ב<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'z-stack Control מחוונים ב-FLIMview, כדי למזער זיהום אות שמקורו בפוטוני רקע בעומקי z אחרים.

4. לחץ על הכפתור + כדי להוסיף את תמונת FLIM לקבוצה (שלב 2.2). לחץ על Calc לחישוב אורך החיים הממוצע (LT, נקרא גם זמן פליטת פוטון ממוצע [MPET]), עבור החזר ההשקעה ושגיאת הערכת אורך החיים (δτ).

5. פתח את הקובץ הבא בסדרת ההדמיה הכרונולוגית 2pFLIM. חזור על שלב 2.4. הקפד להתאים את המיקום של טווח ה-ROI וה-z-stack כדי למדוד את אותה סומה חיובית ל-tAKARα לאורך זמן, מכיוון שיכולה להיות סחיפה של רקמות לאורך זמן.

6. בחר את deltaMPET/MPET₀ בתפריט הנפתח של פקדי קבוצה module. לחץ על baseline# והיכנס לאינדקסים (למשל, 1 2 3 4 5 עבור חמש התמונות הראשונות בקבוצה שנוצרה בשלב 2.3). זה יגדיר את התמונות המשמשות לחישוב אורך החיים הבסיסי (LT₀).

7. לחץ על Plot כדי ליצור גרף המכיל את תגובת FLIM (ΔLT/LT₀) של tAKARα במהלך הניסוי ב-ROIs המוגדרים. שינויים מנורמלים לאורך החיים (ΔLT) של החזר ROI בודד לפי אורך החיים הבסיסי המתאים (LT₀) מאפשרים השוואה של פעילות PKA במהלך תנועה על פני החזר ROI שונה.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ דו-פוטוני	N/A	N/A
ScanImage 3.6	Svoboda Lab/Vidrio Technology	N/A
תוכנת FLIMview MATLAB	N/A	N/A
16x 0.8 NA טבילה במים {{}}	Nikon	MRP07220
תוכנת AnimalTracker MATLAB	N/A	}N/A	}
מערכת יישור סטריאוטקסית	דוד kopf	1900
Virus: tAKARα (AAV2/1 hSyntAKARα-WPRE)	Addgene	119921
	N/A	N/A
N/A	N/A
כיסוי עגול (קוטר 5 מ"מ)	r) VWR	101413-528	}

{{TAG_ 91}}מחזיק לוחית ראש