הדמיה תלת מימדית של זיהום בנגיף הכלבת ברקמת מוח של עכבר

תקציר

מקור: Zaeck, L., et al.} הדמיה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של זיהום בנגיף הכלבת ברקמת מוח מנוקה ממסים. J. Vis. exp. (2019).

סרטון זה מדגים את תהליך ההכנה וההדמיה של רקמת מוח של עכברים שנדבקו בנגיף הכלבת (RABV) כדי להעריך את התקדמות ההדבקה. הוא מתאר שלבים מרכזיים, כולל צביעת רקמות עם סמנים פלואורסצנטיים, התייבשות, ניקוי והרכבה למיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי, ששיאו ביצירת ייצוג תלת מימדי.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

חומר מוחי שנדבק ב-RABV, paraformaldehyde (PFA)-fixed נעשה שימוש.

} זהירות:} פרוטוקול זה משתמש בחומרים רעילים ו/או מזיקים שונים, כולל PFA, מתנול (MeOH), מי חמצן (H₂O₂), נתרן אזיד (NaN₃), }-בוטנול (TBA), בנזיל אלכוהול (BA), בנזיל בנזואט (BB) ודיפניל אתר (DPE). MeOH ו-TBA דליקים מאוד. הימנע מחשיפה על ידי לבישת ציוד מגן אישי מתאים (חלוק מעבדה, כפפות והגנה על העיניים) וביצוע ניסויים במכסה אדים. יש לאסוף פסולת בנפרד במיכלים מתאימים ולהשליך אותה בהתאם לתקנות המקומיות. נגיף הכלבת מסווג כפתוגן ברמת בטיחות ביולוגית (BSL)-2 ולכן ניתן לטפל בו בדרך כלל בתנאי BSL-2. פעילויות מסוימות, כולל הליכים שעלולים ליצור אירוסולים, לעבוד עם ריכוזי וירוסים גבוהים או לעבוד עם נגיפי ליססה חדשים, עשויות לדרוש סיווג BSL-3. טיפול מונע לפני חשיפה מומלץ לאנשי צוות בסיכון גבוה, כולל מטפלים בבעלי חיים ועובדי מעבדה. עיין בתקנות הרשות המקומית.

1. קיבוע רקמת המוח וחתך

1. } תקן דגימות מוח בנפח מתאים של 4% PFA בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS [pH 7.4]) למשך 48 שעות לפחות ב-4 מעלות צלזיוס (עם יחס משוער בין רקמה לקיבוע של 1:10 [v/v]).
2. יש לשטוף את דגימות הטישו 3 פעמים ב-PBS למשך 30 דקות לפחות בכל שטיפה ולאחסן אותן ב-0.02% NaN₃/PBS ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
3. חתכו את הרקמה למקטעים בעובי 1 מ"מ באמצעות ויברטום (קצב הזנת הלהב: 0.3-0.5 מ"מ לשנייה, משרעת: 1 מ"מ, עובי פרוסה: 1,000 מיקרומטר).
4. כדי לשמור על רצף הפרוסות הנכון, אחסן כל קטע רקמה בנפרד בבאר של צלחת תרבית תאים מרובת בארות. הוסף 0.02% NaN₃/PBS ואחסן את חלקי הרקמה ב-4 מעלות צלזיוס עד לשימוש.

2. טיפול מקדים לדוגמה במתנול

} הערה: בצע את כל שלבי הדגירה בתנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. הגן על הדגימות מפני אור. הטיפול המקדים לדוגמה משרת את המטרה הכוללת של שיפור דיפוזיה של נוגדנים והפחתת אוטופלואורסצנטיות של רקמות על ידי חשיפה ל-MeOH ו-H₂O{{}}₂, בהתאמה.

1. הכן תמיסות 20% (v/v), 40%, 60% ו-80% MeOH במים מזוקקים. לדוגמה, עבור 20% MeOH, הוסף 10 מ"ל של 100% MeOH ל-40 מ"ל מים מזוקקים בכלי אטום מתאים וערבב על ידי היפוך.
2. העבירו את הדגימות לכלים בגודל סביר (למשל, צינורות תגובה של 5 מ"ל). הקפד להשתמש בחומרים עמידים כימית לריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. לדוגמה, שימו לב שבעוד שפוליפרופילן מתאים, פוליסטירן לא.
   הערה: מפרט הנפח בפרוטוקול זה מתייחס לצינורות תגובה של 5 מ"ל. אם נעשה שימוש בכלי אחר, התאם את עוצמת הקול בהתאם.
3. דגרו את הדגימות ב-4 מ"ל מכל ריכוז של הסדרה המוכנה של תמיסות MeOH בסדר עולה למשך שעה אחת כל אחת.
4. דגרו את הדגימות פעמיים למשך שעה כל אחת ב-MeOH טהור (100%).
5. מצננים את הדגימות ל-4 מעלות צלזיוס (למשל, במקרר בטוח למעבדה).
6. הכינו תמיסת הלבנה (5% H₂O₂ ב-MeOH) על ידי, למשל, דילול תמיסת מלאי של 30% H₂O₂{{}}} תמיסת מלאי ב-1:6 אינץ' טהור (100%) MeOH, וקרר אותו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
7. הסר את 100% MeOH מהדגימות בקירור והוסף 4 מ"ל של תמיסת הלבנה מקוררת מראש (5% H₂}O₂} ב-MeOH). דגירה למשך הלילה בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
8. החלף את תמיסת ההלבנה ב-4 מ"ל של 80% MeOH ודגר למשך שעה. המשך להשתמש בסדרה המוכנה של תמיסות MeOH בסדר יורד למשך שעה אחת כל אחת עד שהדגימות הודגרו למשך שעה אחת ב-4 מ"ל של 20% MeOH.
9. שטפו את הדגימות 1x למשך שעה עם 4 מ"ל PBS.

3. צביעה חיסונית

} הערה: בצע את כל שלבי הדגירה בתנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. הגן על הדגימות מפני אור. כדי למנוע צמיחה מיקרוביאלית, הוסף NaN₃ לריכוז סופי של 0.02% לתמיסות בסעיף זה. דגימות רקמה מחלחלות עוד יותר על ידי טיפול בחומרי ניקוי לא יוניים Triton X-100 ו-Tween 20. סרום רגיל משמש לחסימת קשירת נוגדנים לא ספציפיים. גליצין והפרין מתווספים כדי להפחית את הרקע של התיוג החיסוני.

1. שטפו את הדגימות פעמיים למשך שעה כל אחת ב-4 מ"ל של 0.2% Triton X-100/PBS.
2. לחלחל את הדגימות למשך יומיים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 4 מ"ל של 0.2% טריטון X-100/20% דימתיל סולפוקסיד (DMSO)/0.3 M גליצין/PBS.
3. חסום את הקישור הלא ספציפי של נוגדנים על ידי דגירה של הדגימות למשך יומיים ב-37 מעלות צלזיוס ב-4 מ"ל של 0.2% טריטון X-100/10% DMSO/6% סרום רגיל/PBS.
   הערה: השתמש בסרום רגיל מאותו המין שבו גדל הנוגדן המשני כדי להשיג תוצאות חסימה אידיאליות.
4. דגרו את הדגימות ב-2 מ"ל של תמיסת נוגדנים ראשונית (3% סרום רגיל/5% DMSO/PTwH [PBS-Tween 20 עם הפרין] + נוגדנים/נוגדנים ראשוניים) למשך 5 ימים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. רעננו את תמיסת הנוגדנים העיקרית לאחר 2.5 ימים.
   1. עבור PTwH, הרכיבו מחדש את מלח הנתרן הפרין במים מזוקקים כדי ליצור תמיסת מלאי של 10 מ"ג/מ"ל (אחסן תמיסה זו, בנקוב, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס). הוסף את תמיסת המלאי ל-0.2% Tween 20/PBS לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם/מ"ל.
      הערה: בחירת דילול הנוגדנים הנכון עשויה לדרוש אופטימיזציה. באופן כללי, ריכוזים סטנדרטיים של אימונוהיסטוכימיה הם נקודת התחלה טובה.
5. שטפו את הדגימות למשך יום אחד ב-4 מ"ל של PTwH, החליפו את מאגר הכביסה לפחות פי 4-5 במהלך היום והשאירו את הכביסה הסופית למשך הלילה.
6. דגרו את הדגימות ב-2 מ"ל של תמיסת נוגדנים משנית (3% סרום/PTwH רגיל + נוגדנים/נוגדנים משניים) למשך 5 ימים ב-37 מעלות צלזיוס. רענן את תמיסת הנוגדנים המשנית לאחר 2.5 ימים.
   1. יש לדלל את הנוגדנים/נוגדנים המשניים ב-1:500 בתמיסת נוגדנים משנית (כלומר, 4 מיקרוליטר ב-2 מ"ל).
7. שטפו את הדגימות למשך יום אחד כמתואר בשלב 3.5, והשאירו את הכביסה הסופית למשך הלילה.

4. צביעה גרעינית

} הערה: בצע את כל שלבי הדגירה בתנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. הגן על הדגימות מפני אור. אם אין צורך בצביעה גרעינית או שנדרש אורך גל העירור/ספקטרום הפליטה של תיאזול אדום (TO-PRO-3) לעירור או זיהוי של פלואורופור אחר, דלג על שלב זה.

1. לדלל את כתם חומצת הגרעין TO-PRO-3 ב-1:1,000 ב-PTwH ולדגור את הדגימות ב-4 מ"ל של תמיסת צביעה גרעינית למשך 5 שעות.
2. }שטוף את הדגימות למשך יום אחד כמתואר בשלב 3.5, והשאיר את הכביסה הסופית למשך הלילה.
   הערה: לאחר השטיפות, ניתן לאחסן את הדגימות ב-PBS בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד לניקוי אופטי.

5. ניקוי רקמות

} הערה: בצע את כל שלבי הדגירה בתנודה עדינה, ואם לא צוין אחרת, בטמפרטורת החדר. הגן על הדגימות מפני אור. דגימות הרקמה מיובשות בסדרה מדורגת של תמיסות TBA. מכיוון שצביעה חיסונית דורשת תמיסות מימיות, יש לסיים את כל הליכי הצביעה לפני ניקוי הרקמות. פינוי אופטי והתאמת מקדם שבירה מושגים על ידי טיפול בתערובת של BA, BB ו-DPE. תמיסת הניקוי מתווספת עם DL-α-טוקופרול כנוגד חמצון.

1. הכינו תמיסות TBA של 30% (v/v), 50%, 70%, 80%, 90% ו-96% TBA במים מזוקקים. לדוגמה, עבור 30% TBA, הוסף 15 מ"ל של 100% TBA ל-35 מ"ל מים מזוקקים בכלי אטום מתאים וערבב על ידי היפוך.
   הערה: ל-TBA יש נקודת התכה של 25-26 מעלות צלזיוס; לפיכך, הוא נוטה להיות מוצק בטמפרטורת החדר. להכנת תמיסות TBA, מחממים את הבקבוק האטום היטב ב-37 מעלות צלזיוס בחממה או באמבט מים.
2. יבש את הדגימות עם 4 מ"ל מכל ריכוז של הסדרה המוכנה של תמיסות TBA בסדר עולה למשך שעתיים כל אחת. השאירו את ה-96% TBA למשך הלילה.
3. ייבשו את הדגימות עוד יותר ב-TBA טהור (100%) למשך 2 שעות.
4. הכינו תמיסת פינוי BABB-D15.
   הערה: BABB-D15 הוא שילוב של BA ו-BB (BABB) אשר מעורבב עם DPE ביחס של x:1, כאשר x מצוין בשם הפתרון, במקרה זה 15.
   1. עבור BABB, מערבבים BA חלק אחד עם שני חלקים BB.
   2. מערבבים BABB ו- DPE ביחס של 15: 1.
   3. יש להוסיף 0.4% נפח DL-α-טוקופרול (ויטמין E).
      הערה: לדוגמה, עבור 20 מ"ל של BABB-D15, מערבבים 6.25 מ"ל של BA עם 12.5 מ"ל של BB. הוסף 1.25 מ"ל DPE והשלים אותו עם 0.08 מ"ל DL-α-טוקופרול.
5. נקה את הדגימות בתמיסת ניקוי עד שהן שקופות אופטית (2-6 שעות).
6. ניתן לאחסן את הדגימות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ב-BABB-D15, מוגנות מפני אור, עד להרכבה והדמיה.

6. הרכבה לדוגמא

1. באמצעות מדפסת תלת מימד, הדפיסו את תא ההדמיה ואת המכסה (חומר: קופוליאסטר [CPE], זרבובית: 0.25 מ"מ, גובה שכבה: 0.06 מ"מ, עובי דופן: 0.88 מ"מ, ספירת קירות: 4, מילוי: 100%, ללא מבנה תמיכה).
2. הרכיבו את תא ההדמיה ( איור 1).
   1. התקן כיסוי עגול (קוטר: 30 מ"מ) על תא ההדמיה עם גומי סיליקון RTV-1 (גיפור בטמפרטורת החדר ברכיב אחד). הסר את עודפי גומי הסיליקון בעזרת צמר גפן רטוב במים ורפא למשך הלילה.
   2. התקן כיסוי עגול (קוטר: 22 מ"מ) על המכסה עם גומי סיליקון RTV-1. הסר את עודפי גומי הסיליקון בעזרת צמר גפן רטוב במים ורפא למשך הלילה.
3. הנח את הדגימה בתא הדמיה, הוסף נפח קטן של BABB-D15 והכנס את המכסה. מלאו את החדר ב-BABB-D15 דרך הכניסה, באמצעות מחט היפודרמית (27 G x 3/4 אינץ' [0.40 מ"מ x 20 מ"מ]).
4. חבר את הכניסה ואטום את תא ההדמיה בגומי סיליקון RTV-1. לרפא לילה בחושך.

7. הדמיה ועיבוד תמונה

1. הגדר את רכישת התמונה על ידי בחירת קווי הלייזר המתאימים כך שיתאימו לפלואורופורים שבהם נעשה שימוש. התאם את טווחי הזיהוי של כל גלאי כדי למנוע חפיפת אותות בין ערוצים.
   הערה: טווחי זיהוי לדוגמה עבור Alexa Fluor 488, Alexa Fluor 568 ו-TO-PRO-3 הם 500-550 ננומטר, 590-620 ננומטר ו-645-700 ננומטר, בהתאמה.
2. בחר את פרמטרי הרכישה, הגדר את הגבול העליון והתחתון של אוסף התמונות z, ורכוש את אוסף התמונות.
   הערה: פרמטרי רכישה לדוגמה הם סריקה רציפה עם גודל פיקסל של 60-90 ננומטר, גודל צעד z של 0.5 מיקרומטר, ממוצע קו של 1, מהירות סריקה של 400 הרץ, וגודל חור סיכה של יחידה אוורירית אחת.
3. עבד את ערימת התמונות באמצעות תוכנת ניתוח תמונה מתאימה (למשל, פיג'י) כדי ליצור הקרנות תלת מימד או לבצע ניתוחים מעמיקים.
   הערה: בגלל הגודל הגדול של קבצי התמונות שנרכשו, השימוש בתחנת עבודה הוא בדרך כלל הכרחי.
   1. פתח את קובץ הרכישה או התמונה בפיג'י (קובץ |{ {TAG_589}} פתח | בחר קבצים).
      1. אם אתה משתמש, לדוגמה, בקובצי LIF, בחר או בטל את הבחירה באפשרויות הרצויות בחלון הדו-שיח Bio-Formats. הצג מחסנית עם }Hyperstack. מלבד זאת, אין צורך בבחירות או סימנים ספציפיים. לחץ על OK.
      2. אם הקובץ מכיל מספר ערימות תמונות, בחר את אלה לניתוח ואשר על ידי לחיצה על OK.
   2. בצע תיקון אקונומיקה על ידי פיצול התמונה הממוזגת לערוצים בודדים (תמונה |{ {TAG_645}} צבע | כלי ערוצים, ואז בחר עוד | {{}}{{TAG_666 TAG_667}}). עבור כל ערוץ, בחר תיקון אקונומיקה ( תמונה | התאם | } תיקון אקונומיקה) ובחר }{{}}} יחס פשוט} (עוצמת רקע: 0.0).
      הערה: במקרים מסוימים, למשל, כאשר אין דעיכה ליניארית של האות או שהאות חלש מדי בסך הכל, יחס פשוט עלול להיכשל. לחלופין, נסו את Exponential Fit או דלגו על תיקון האקונומיקה.
   3. התאם את הבהירות והניגודיות עבור כל ערוץ באמצעות המחוונים (תמונה |{ {TAG_724}} התאמת | } בהירות | } ניגודיות).
   4. מיזוג הערוצים (תמונה |{ {TAG_754}} צבע | מיזוג ערוצים}), יצירת קומפוזיציה (TAG_769{{}}}| TAG_775{{}}}| }TAG_781{{}}{{}}}}}, לאחר מכן בחר עוד | צור קומפוזיט), והמר אותו לפורמט RGB (תמונה | צבע | כלי, ואז בחר עוד | } המרה ל-RGB).
   5. במידת הצורך, שנה את גודל ערימת התמונות כדי להקטין את זמן החישוב ואת גודל הקובץ (תמונה | {{}}{{TAG_841 TAG_842}}| {{}}, שתי האפשרויות סומנו בתוספת אינטרפולציה דו-ליניארית).
   6. יצירת הקרנה תלת-ממדית (תמונה | {{}} ערימות | } פרויקט תלת-ממדי). בחר }הנקודה הבהירה ביותר כשיטת הקרנה והגדר את ריווח הפרוסות כך שיתאים לגודל צעד z של ערימת התמונות שנרכשה. לאיכות מקסימלית, הגדירו את תוספת זווית הסיבוב ל-1 ואפשרו אינטרפולציה. שנה את הסיבוב הכולל, סף השקיפות והאטימות בהתאם לצורך.
   7. במידת הצורך, התאימו מחדש את הניגודיות והבהירות על ידי המרת ההקרנה התלת-ממדית בחזרה לפורמט של 8 סיביות (| הקלד | } 8 סיביות). השתמש במחוונים המתאימים ( תמונה | התאם | } בהירות | } ניגודיות) והמר מחדש את ערימת התמונות לפורמט RGB כמתואר בשלב 7.3.4.
   8. שמור את ההקרנה התלת-ממדית כ- . קובץ TIF (פורמט קובץ תמונה) וקובץ .AVI (פורמט קובץ וידאו).

תוצאות

חומרים