כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הסקירה האתית המתאימה של בעלי חיים ועדה.
1. כיול
- הפעל את המיקרוסקופ לפחות שעה אחת לפני ההדמיה כדי לאפשר ייצוב תרמי של מקור הלייזר (ראה טבלת חומרים). לאחר מכן, הפעל את התוכנה לסריקה ספקטרלית (ראה טבלת חומרים) ולחץ על הלחצן Acquire בחלק העליון של ממשק המשתמש הגרפי (ממשק משתמש גרפי) (איור 1a).
- הפעל את תריס התוכנה עבור לייזר האור הלבן (WLL) ושפופרת מכפיל האור (PMT) (איור 1a).
- בחר את מצב xyΛ ברשימה הנפתחת במצב רכישה, ואז מצב קלט הלייזר משתנה אוטומטית מאחוז קבוע להספק קבוע. בטל את הסימון בתיבת הסימון של תנועת SP אוטומטית. לאחר מכן, הגדר את החלון הספקטרלי של לייזר הקלט ל-470-670 ננומטר ואת גודל הצעד הספקטרלי ל-4 ננומטר ב-Λ-Excitation Lambda Scan Settings (איור 1b).
- הגדר את הטווח הספקטרלי של PMT ל-450-690 ננומטר על-ידי לחיצה כפולה או הזזה של סרגל ההתאמה עבור הטווח הספקטרלי (איור 1c).
note: טווח ספקטרלי זה צריך לכלול את רוחב הפס המלא של מקור הקלט. - בחר עדשה אובייקטיבית טבולה במים, מתאימה עם צמצם מספרי גבוה (NA > 0.7) ותן כל ערך ל-PMT ולעוצמת לייזר כדי להפעיל את AOBS (מפצל אלומה אקוסטו-אופטי) configuration and Live Scan button. החלף את הנתיב האופטי על-ידי בדיקת ההשתקפות בתצורת AOBS (איור 1d).
- התקן מראת ייחוס (ראה טבלת חומרים) על שלב המיקרוסקופ. משטח המראה צריך להיות פונה כנגד עדשת האובייקטיב. אם לא קל להרכיב את המראה על במת המיקרוסקופ, הצמד מראה על לוח שטוח (למשל , שקופית זכוכית).
- שלוט במיקרוסקופ stage כדי ליישר את מישור המוקד למשטח המראה.
- כוונן את רווח ה-PMT ואת עוצמת הלייזר, בהתחשב בטווח הדינמי של הגלאי, ולאחר מכן שנה את מצב כניסת הלייזר מאחוז קבוע להספק קבוע.
note: כמקובל, הגבר PMT של 500 (V) והספק לייזר יחסי של 0.1% משמשים ב-570 ננומטר. - אשר במצב פסאודו-צבע כדי לבדוק שאין רוויה בכל טווח אורכי הגל. אם נצפתה רוויה, הנמיכו את עוצמת הלייזר (איור 1a).
- הפעל את רכישת Lambda Scan.
- הסר את המראה מהבמה וחזור על אותה רכישה ללא דגימה על מנת לקבל את ההפניה הכהה (i.e., קיזוז כהה).
- שמור את הנתונים בתבנית TIF מרובת ערימות.
2. SpeRe (רפלקטומטריה ספקטרלית) רכישת תמונות
- הנח את הרקמה המותקנת על במת המיקרוסקופ. כדי ליישר בערך את הרקמה למישור המוקד של עדשת האובייקט, השתמש במצב הקרינה בשדה רחב דרך עינית.
- עם <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Live Scan, שלוט בשלב המיקרוסקופ כדי ליישר את מישור המוקד לאזור העניין ברקמה. כדי למנוע רעשי רקע מהחלקת הכיסוי, בחר את אזור היעד בעומק של לפחות 15 מיקרומטר מממשק רקמת הזכוכית.
- רכוש את ערימת התמונות הספקטרליות עבור אזור היעד באמצעות אותו הליך כמתואר בשלבים 1.1-1.10.
- שמור את הנתונים עבור הרקמה וההיסט הכהה בMultistacked TIF format.
note: הנסיין עשוי לעצור בשלב זה.
3. עיבוד וניתוח תמונה
- פתח את הנתונים הספקטרליים (TIF מרובה ערימות) עבור מראת הייחוס ורקמת המוח ב-ImageJ.
- בחר את ה-ROIs (אזורי עניין) עבור ערימות התמונות שנפתחו - האזור המרכזי עבור מראת הייחוס והמקטע של סיב אקסון עבור רקמת המוח.
- רכוש את הספקטרום הגולמי עבור החזר ההשקעה שנבחר על ידי הפעלת Image → ערימות → התוויית פרופיל ציר Z בתפריט ImageJ.
- פתח את נתוני ההיסט הכהה, אחד נלקח עבור מראת הייחוס והשני עבור רקמת המוח.
- רכוש את הספקטרום עבור ההיסטים הכהים על ידי הפעלת Image → ערימות → התוויית פרופיל ציר Z בתפריט ImageJ.
- שמור את כל הספקטרום שנרכש באמצעות Copy and Paste אפשרויות.
note: עבור הדמיית SpeRe, מומלץ להשתמש בשדה ההדמיה המרכזי כדי למזער סטיות אופטיות מחוץ לציר. סיבי האקסון עשויים להיות הטרוגניים מבחינה מבנית לאורכם. לפיכך, מומלץ לבחור את ההחזר על ההשקעה על מקטע אקסון קטן, בדרך כלל < 5 מיקרומטר, כדי למזער חפץ בנפח חלקי.
