הדמיה של הקרנות נוירונים מוטוריים והסתעפות אקסונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי של יריעות אור

תקציר

source: Liau, E. S. et al. הדמיה של ניווט אקסון מוטורי וכימות של ארבוריזציה של אקסונים בעוברי עכברים באמצעות מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור. J. Vis. Exp. (2018).

סרטון זה מדגים את השימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור כדי להמחיש הקרנות נוירונים מוטוריים והסתעפות אקסונים ב עוברי עכברים טרנסגניים. הוא מתאר את השלבים הכרוכים בהכנת דגימה, הדמיה ושחזור תלת מימד של הסתעפות אקסונלית להערכת צמיחה וקישוריות של נוירונים מוטוריים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי האתיקה המתאימה לבעלי חיים ועדת ביקורת.

1. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של גיליון אור (LSFM) (2-3 שעות)

1. הגדרה לדוגמה
   1. הגדר אופטיקה של תאורה 5X/0.1 ו-5X/0.16 זיהוי אופטיקה. הרכיבו את מחזיק הדגימה ואת נימי הדגימה (קוטר פנימי של 1.5 מ"מ, ירוק) והניחו אותם במיקרוסקופ.
      NOTE: עיין במדריך ההפעלה של המיקרוסקופ להליכי התקנה מפורטים.
   2. הרכיב את העובר באופן הבא:
      1. הכן את קצה הפיפטה P200 על ידי חיתוך החלק העליון כך שיתאים לקוטר הנימים והסר את החלק המחודד (~ 3 מ"מ) עבור חיבור הדגימה.
      2. ממיסים את הקצה הקהה של קצה הפיפטה בעזרת להבה קטנה.
      3. כבו את הלהבה והצמידו במהירות את העובר אנכית לקצה המומס.
      4. התקן את החלק העליון של קצה הפיפטה עם נימי הדגימה.
   3. אפשר למאגר התא להתאזן עם העובר למשך דקה אחת כדי לפנות פסולת או בועות.
   4. באמצעות תוכנת ההדמיה, בחר Locate capillary תחת אתר טאב והתאם את צירי x, y ו-z כדי למקם את הנימים לדוגמה.
   5. בחר אתר sample וזום ל-0.6X כדי להתמקד בעובר. סובב את העובר כדי לוודא שהציר הארוך של הגפה המצולמת מיושר עם נתיב האור של שני מקורות האור (איור 1B).
2. רכישת תמונה
   1. תחת <span style='משפחת גופנים:Arial,sans-serif;גודל גופן:12pt;סגנון גופן:רגיל;משתנה גופן:רגיל;קישוט טקסט:ללא;יישור אנכי:קו בסיס;רווח לבן:גלישה מוקדמת;'>רכישה tab, הגדר את פרמטרי נתיב האור כגון יעדי זיהוי, מסנן חסימת לייזר, מפצל קרן, מצלמות ולייזרים.
      NOTE: תעלת החלבון הפלואורסצנטי הירוק (GFP) משמשת בניסוי זה (אורך גל עירור: 488 ננומטר; מסנן פליטה: פס פס (BP) 505 עד 545 ננומטר; מפצל קרן: SPS LP 560).
   2. סמן את תיבת הסימון של סריקת הציר להפחתת צל.
   3. הגדר את הגדרות הרכישה: עומק סיביות, 16 סיביות; זום, 0.36-0.7X; תאורה חד צדדית (שמאל/ימין) או תאורה דו-צדדית.
   4. לחץ על Continuous והגדר את עוצמת הלייזר, זמן החשיפה, עוצמת הלייזר ומיקום גיליון האור כדי להשיג תמונות חדות יותר.
      NOTE: עוצמת הלייזר נשמרת נמוכה ככל האפשר כדי למזער נזקי אור.
   5. לחץ על STOP to end image acquisition.
3. רכישה רב-ממדית
   1. הגדר את z-stack על-ידי הזזת מיקום Z עבור התמונה הראשונה והאחרונה. לחץ על Optimal כדי להגדיר את מספר הפרוסה.
   2. לחץ על Start Experiment כדי להשיג את z-stack שנבחר.
   3. בסיום, שמור את התמונה בפורמט .czi.
4. עיבוד תמונה (אופציונלי)
   1. המשך עם מיזוג צדדי כפול תחת עיבוד גיליון אור ערוץ אם מוחלת תאורה דו-צדדית. עיבוד Multiview נחוץ אם נרכשות תצוגות מרובות כדי לשלב תמונות מזוויות מרובות.
   2. צור תמונה דו-ממדית באמצעות נתונים מהפיקסלים בעלי העוצמה הגבוהה ביותר לאורך ציר ההקרנה תחת Maximum Intensity Projection.
   3. תחת Copy ערוץ, לחץ תת-ערכה לבחירת קבוצות משנה של תמונות מהערכה המקורית.

2. כימות של ארבוריזציה של אקסון (30 דקות לכל עצב בודד)

1. פתח את קובץ התמונה בתוכנת ניתוח ההדמיה (כברירת מחדל, התמונה המכילה את נתוני XYZ נפתחת במצב Surpass וכתצוגה תלת-ממדית).
2. התאם את הצבע, הבהירות והניגודיות של התמונה באמצעות Display Adjustmentwindow (Edit | הצג התאמת תצוגה) כדי לזהות חוטים על סמך ניגודיות עוצמה מקומית.
3. לחץ על Add New filments ובחר בסמל נתיב אוטומטי (ללא לולאה)<span style='משפחת גופנים:Arial,sans-serif;גודל גופן:12pt;סגנון גופן:רגיל;משתנה גופן:רגיל;משקל גופן:400;קישוט טקסט:ללא;יישור אנכי:קו בסיס;רווח לבן:גלישה מוקדמת;'> אלגוריתם בתפריט הנפתח.
4. בחר את אזור העניין (במקרה זה, אקסון הפילוח של העניין). לחץ על next בסיום.
5. הגדר את נקודות ההתחלה והזרע על ידי הקצאת מידות הקוטר הגדולות והדקות ביותר, שניתן למדוד באמצעות Slice .
6. הקצה נקודת התחלה בקצה אזור העניין. כדי להשיג הוספה או הסרה ידנית של נקודות התחלה, שנה תחילה את מצב המצביע (Navigate | בחר) ולאחר מכן Shift + לחיצה ימנית בנקודות העניין.
7. בחר ערכי סף ידניים לנקודות זרע כדי להבטיח שכל העצבים הגלויים מסומנים. שינוי מצב המצביע (Navigate | select) ולאחר מכן Shift + לחיצה שמאלית בנקודות העניין להוספה או הסרה ידנית של נקודות seed.
   NOTE: חשוב להסיר ידנית רעשי רקע ואותות מעצבים שכנים.
8. סמן את התיבה הסר נקודות זרע סביב נקודות התחלה.
9. בדוק הסר מקטעים מנותקים לאפשר אי הכללה של נקודות רחוקות מדי, שעלולות לייצג רעשי רקע. ציין את Maximum Gap Length בשלב הבא להגדרת הגבול העליון עבור הדרה.
10. התאם את הסף לחיסור רקע, המשתמש במסנן גאוס כדי להעריך את עוצמת הרקע של כל ווקסל.
11. הגדר את הסף האוטומטי לקוטר דנדריט באמצעות שטח חתך משוער algorithm.
12. דלג על השלבים לחישוב עמוד השדרה.
13. סיים את התהליך ובחר את הסגנון והצבע הרצויים.
14. בטל את הסימון בתיבת עוצמת הקול במאפיינים כדי להציג רק את האקסונים המשוחזרים.
15. תחת סטטיסטיקה tab, בחר מפורט. השתמש בנימה מס'. Dendrite Terminal Points כדי לכמת את מסופי העצב המוטורי כאינדיקטור לארבוריזציה של אקסון מוטורי.
    NOTE: סטטיסטי ניתן להוסיף הערות אם רוצים.
16. ייצא את התמונה של האקסון המשוחזר כקובץ .tif.

תוצאות

חומרים