הדמיה היסטוכימית של מודולים בקליפת המוח במקטעי מוח שטוחים

תקציר

מקור: Lauer, S. M., et al. ויזואליזציה של מודולים קליפת המוח בקליפות יונקים שטוחות. J. Vis. Exp. (2018)

סרטון זה מדגים שיטה להמחשת המודולים בקליפת המוח בחלקי מוח שטוחים באמצעות צביעה היסטוכימית. קטעים קבועים מראש מטופלים במגיב מאמץ המדגיש אשכולות עצביים פעילים, ויוצר אזורים כהים בעלי ניגודיות גבוהה. לאחר הרכבה והתייבשות, מודולים בקליפת המוח מופיעים תחת מיקרוסקופ שדה בהיר כדפוסים כהים וטלאים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. ויזואליזציה של מודולים קליפת המוח באמצעות צביעת ציטוכרום אוקסידאז

הערה: פרוטוקולי צביעה שונים פותחו לזיהוי היסטוכימי של פעילות ציטוכרום אוקסידאז. פרוטוקול זה משתמש בניקל-אמוניום סולפט (NiAS), וכתוצאה מכך ניגודיות גבוהה יותר ומודולים מוגדרים טוב יותר באזורים מוכתמים בקליפת המוח.

1. הכן את תמיסת הצביעה של ציטוכרום אוקסידאז. עבור 10 מ"ל תמיסה, הוסף 10 מ"ל של חומצה 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיאנסולפונית (HEPES) (0.1 M, pH 7.4), 400 מ"ג סוכרוז, 12.5 מ"ג NiAS, 2 מ"ג ציטוכרום C ו-6 מ"ג דיאמינובנזידין (DAB).
   זהירות: DAB ו-NiAS הם מסרטנים.
   הערה: הוסף DAB ממש לפני הדגירה של הסעיפים.
2. שטפו את החלקים במאגר HEPES (0.1 מ', pH 7.4) על שייקר למשך 15 דקות.
3. דגרו את החלקים בתמיסת הצביעה בטמפרטורת החדר על שייקר.
   הערה: שימו לב למהירות הצביעה. אם אין תגובה נראית לעין, החלף לדגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. בהתאם לכמות הקיבוע, ניתן להבחין בכתמים לאחר 10 דקות או תוך מספר שעות.
4. עצור את התגובה על ידי הוספת 4% פרפורמלדהיד (PFA); זה מונע מוות חוזר לא רצוי ועלייה באות הרקע.
5. שטפו את הקטעים שלוש פעמים באמצעות מאגר HEPES למשך 10 דקות.
6. הרכיבו וייבשו את החלקים על שקופיות זכוכית.
7. ייבשו את הקטעים עם שורת אלכוהול הולכת וגוברת:
   1. שטפו את השקופיות ב-60% אתנול למשך דקה. שוטפים את השקופיות באתנול 80% למשך דקה. שוטפים את השקופיות באתנול 96% למשך 2 דקות. שוטפים את השקופיות באתנול 100% למשך 3 דקות. שוטפים את השקופיות באיזופרופנול למשך 5 דקות. שטפו את השקופיות בקסילן למשך 5 דקות.
8. הוסיפו מיד אמצעי הרכבה מהיר והוסיפו כיסוי. קריטי: אין להשתמש באמצעי הרכבה על בסיס מים, מכיוון ש-NiAS יישטף ויפגע בכתמים.
9. שמור את החלקים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח הארוך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צביעת
ציטוכרום c מלב סוסים	Sigma-Aldrich	C2506
3,3'Diaminobenzidine tetrahydrochloride hydrate	Sigma-Aldrich	D5637
HEPES	קארל רוט	9105.4
אמצעי
יוקיט (היסטוכימיה)	סיגמא-אולדריץ'	3989
התייבשות
אתנול 100%	קארל רוט	9065.3
אתנול 96%	קארל רות'	P075.3
2-פרופנול	קארל רוט	6752.4
תחליף קסילן	Fluka	78475
מכשירים/כלים
Dumont 55 מלקחיים - Inox	Fine Science Tools	11255-20
Dumont 5 מלקחיים - Inox Biology Tip	Fine Science Tools	11252-30
Dumont 5SF מלקחיים - Inox Super Fine Tip	Fine Science Tools	11252-00

ציטוכרום אוקסידאזהרכבה או הקפאהאלכוהול