ניתוח תאים חיסוניים ברקמות עצבים של עכברים באמצעות ציטומטריית זרימה

תקציר

מקור: Hidmark, A. S., et al. ניתוח של תאים חיסוניים בעצבים סיאטיים בודדים ובגנגליון שורש הגב מעכבר בודד באמצעות ציטומטריית זרימה. J. Vis. exp.{{TAG_ 27}} (2017).

}סרטון זה מדגים את השימוש בזרימה ציטומטרית לניתוח תאי חיסון בעצבים סיאטיים של עכברים ובגרעיני שורש גב (DRGs). התהליך כולל תיוג תאים חיסוניים עם נוגדנים מתויגים פלואורופור וביוטין, ייצוב וחדירה של התאים, ושימוש בסמנים פלואורסצנטיים כדי לזהות מאפיינים של פני התא והגרעין. הטכניקה מאפשרת הערכה כמותית של הטרוגניות של תאי מערכת החיסון ברקמות העצבים.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. עיכול של עצב סיאטי ו-DRG

1. הכינו את אמצעי העיכול (מדיום הנשר המותאם של דולבקו [DMEM], 10 מ"מ 4-(2-הידרוקסיאתיל)-1-פיפרזינאתיאנסולפוניק חומצה [HEPES], 5 מ"ג/מ"ל אלבומין בסרום בקר [BSA], 1.6 מ"ג/מ"ל קולגנאז סוג 4) בתוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל של דאוקסיריבונוקלאז, ולאחסן על קרח.
   הערה: כמות אמצעי העיכול הנדרשת לכל עכבר (עצבים סיאטיים + DRGs) היא 1 מ"ל. לאחר ההכנה, ניתן לאחסן את הכמות של אמצעי העיכול בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
2. העבירו את העצבים הסיאטיים וה-DRG מעכבר אחד לצינורות נפרדים של 1.5 מ"ל המכילים 500 מיקרוליטר של אמצעי עיכול. עבור העצבים הסיאטיים, קוצצים את החומר ל-15-20 חתיכות בעזרת מספריים קפיציים ולאחר מכן דוגרים את מתלי הרקמה באינקובטור רועד ב-37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם תסיסה עדינה (≤-450 סל"ד).
3. טריטוציה חוזרת ונשנית של תרחיף התא דרך קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר כדי לנתק מכנית כל רקמה מעוכלת שלא בשלמותה.
   הערה: אם קשה לטטר את המתלה, חתוך את קצה הפיפטה במספריים כדי ליצור קצה קהה. דגרו את תרחיף הרקמות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות עם תסיסה עדינה (≤ 450 סל"ד).
4. חזור על הטריטורציה דרך קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר ודגירה למשך 10 דקות נוספות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה עדינה (≤ 450 סל"ד).
5. הכן את מאגר ה-FACS (תמיסת מלח חוצצת פוספט [PBS] בתוספת 10% סרום עגל עוברי [FCS] וחומצה אתילנדיאמין טטראצטית של 1 מ"מ [EDTA]) ואחסן על קרח. שטפו והשרו מסך מפלדת אל-חלד בגודל רשת של 140 מיקרומטר עם מאגר מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS) בצלחת פטרי בגודל 60 x 15 מ"מ על קרח.
   הערה: יש להימנע ממסנני מסך ניילון מכיוון שזה מוביל לאובדן משמעותי בתפוקה של תאים גרעיניים.
6. העבירו שוב ושוב את מתלי הרקמות דרך מסנן המסך של 140 מיקרומטר, כפי שהוא מוחזק מעל צלחת הפטרי, עם מלקחיים קהים, על קרח. אוספים את תרחיף התאים מצלחת הפטרי ומעבירים אותו לצינור חדש של 1.5 מ"ל המאוחסן על קרח.
7. דחף כל רקמה מעוכלת שנותרה על המסנן על ידי טריטורציה חוזרת עם קצה פיפטה של 1,000 מיקרוליטר. שטפו את מסנן המסך פעמיים עם 500 מיקרוליטר של מאגר FACS ואספו את תרחיף התאים שנוצר בצלחת פטרי כדי לשלב עם מתלה התא משלב 1.6.
   הערה: אם ציטומטר הזרימה המשמש רגיש לפסולת, ניתן להעביר את תרחיף התא משלב 1.7 דרך מסנן מסך של 70 מיקרומטר; עם זאת, זה עלול להוביל לאובדן בתפוקה של תאים גרעיניים.
8. צנטריפוגה את מתלי התא ב-300 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את כדור התא ב-1 מ"ל של מאגר FACS. חזור על שלב כביסה זה פעם אחת.
9. השעו מחדש את גלולת התא ב-150-350 מיקרוליטר של מאגר FACS, בהתאם למספר הצביעה הנדרשת (מאגר FACS של 150 מיקרוליטר לכל לוח צביעה).

2. צביעה של עצב סיאטי ו-DRG עם נוגדנים בעלי תווית פלואורסצנטית לציטומטריית זרימה

1. העברת 100 מיקרוליטר של העצב הסיאטי או תרחיף תאי DRG לבאר בצורת V בצלחת של 96 בארות על קרח.
   הערה: תאים מוכתמים בודדים נחוצים לכל הנוגדנים המשמשים מכיוון שהם יספקו את הבקרות הדרושות להגדרת ציטומטריית הזרימה ביחס לרווחי מתח ופיצוי של שפופרת מכפיל פוטו (PMT), כמו גם כדי לעזור להבחין בין קישור ספציפי ולא ספציפי.
2. אסוף את תרחיפי התאים הנותרים (כ-50 מיקרוליטר לדגימה) מהעצבים הסיאטיים או מדגימות DRG, כדי לשמש כבקרה לא מוכתמת.
3. צנטריפוגה את הצלחת ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט על ידי היפוך הצלחת מעל פח ומריחת תנועה חדה של פרק כף היד, וטפחו בעדינות על יבש על מגבות נייר.
4. לצביעה על פני השטח, השעו מחדש כל אחד מכדוריות התא ב-20 מיקרוליטר של מאגר FACS המכיל את הנוגדנים המעניינים (CD45-A647, CD11b-PerCP/Cy5.5, וקומפלקס תאימות היסטולוגית עיקרי [MHC] Class II-Biotin) ודגירה, מוגנת מאור, על קרח למשך 30 דקות.
   } הערה: (1) יש לקבוע את דילול הנוגדנים האופטימלי לפני השימוש על ידי ביצוע דילול סדרה על פי פרטי המוצר של היצרן; (2) ניתן להפחית כתמים לא ספציפיים על ידי דגירה עם בלוק Fc בשלב זה, בהתאם להוראות היצרן; ו-(3) צביעת בקרת איזוטיפ בדרך כלל אינה נדרשת בעת שימוש בנוגדנים ראשוניים המצומדים ישירות עם פלואורופור ו/או כאשר האנטיגן/ים המעניינים מייצרים אוכלוסיות נפרדות.
5. הוסף 130 מיקרוליטר של מאגר FACS לכל באר וצנטריפוגה את הצלחת ב-400 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את ה-supernatant כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.3) ושטפו את כדורי התא פעמיים עם 150 מיקרוליטר של מאגר FACS.
   הערה: אם משתמשים בנוגדנים ראשוניים לא מצומדים או בנוגדנים ראשוניים מצומדים לביוטין, ניתן להוסיף מגיב משני מתאים, מצומד לפלואורופור, בשלב זה ולחזור על שלבים 2.4-2.5. במקרה של פרוטוקול זה, נעשה שימוש בסטרפטווידין-PE/Cy7 או סטרפטווידין-פרCP לאיתור MHC Class II בשילוב עם CD45-A647/CD11b-PerCP/Cy5.5, או בשילוב עם CD68-APC ו-F4/80-PE/Cy7, בהתאמה.
6. לצורך קיבוע, לאחר שלב הכביסה האחרון, השעו מחדש את כדורי התא ב -100 מיקרוליטר של 4% פרפורמלדהיד ב- PBS (pH 7.4). דגרו את הצלחת על קרח למשך 10 דקות ולאחר מכן צנטריפוגה ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השליכו את הסופרנטנט כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.3) ושטפו את כדורי התא פעם אחת עם 150 מיקרוליטר של מאגר FACS.
   אזהרה: פרפורמלדהיד רעיל; ללבוש אמצעי הגנה מתאימים כגון כפפות ומשקפיים, וכו'.
   הערה: השהה מחדש את כדורי התא ב-150 מיקרוליטר של מאגר FACS ואחסן מוגן מפני האור, ב-4 מעלות צלזיוס למשך עד יומיים. אם אין צורך בצביעה תוך-תאית, המשך לשלב 2.11 לאחר צנטריפוגה של הצלחת ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
7. לצביעה תוך-תאית, השעו מחדש את כדורי התא ב-150 מיקרוליטר של מאגר FACS + 0.5% חומר ניקוי, ודגרו בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור למשך 15 דקות. צנטריפוגה את הצלחת ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השלך את הסופרנטנט כפי שתואר קודם לכן (שלב 2.3) ושטוף את כדור התא פעם אחת עם 150 מיקרוליטר של מאגר FACS + 0.5% חומר ניקוי. השעו מחדש את גלולת התא ב-20 מיקרוליטר של מאגר FACS + 0.5% חומר ניקוי המכיל את הנוגדנים המעניינים (CD68-APC, CD206-PE) ודגרו, מוגן מאור, בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
8. הוסף 130 מיקרוליטר של מאגר FACS + 0.5% חומר ניקוי לכל באר וצנטריפוגה את הצלחת ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס. השלך את הסופרנטנט כקודם מתואר (שלב 2.3) ושטוף את כדורי התא פעמיים עם 150 מיקרוליטר של מאגר FACS + 0.5% חומר ניקוי.
   הערה: אם משתמשים בנוגדנים ראשוניים לא מצומדים או בנוגדנים ראשוניים מצומדים לביוטין, ניתן להוסיף מגיב משני מתאים, מצומד לפלואורופור, בשלב זה ולחזור על שלבים 2.9-2.10.
9. השעו מחדש את כדוריות התא ב-150 מיקרוליטר של מאגר FACS + 0.5% חומר ניקוי ואחסנו, מוגנים מפני האור, בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך עד יומיים.
10. השעו מחדש את כדורי התא עם מאגר FACS של 150 מיקרוליטר + 0.5% חומר ניקוי בתוספת 5 מיקרוגרם/מ"ל4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) ודגרו למשך 5 דקות בטמפרטורת החדר, מוגנים מפני האור. צנטריפוגה את הצלחת ב-400 x גרם למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.
11. השעו מחדש את כדורי התא ב-150 מיקרוליטר של PBS והעבירו לצינור FACs עם תווית מתאימה. יש לאחסן בטמפרטורת החדר, מוגן מפני האור, עד שמוכן לניתוח.
    הערה: לאחר ההשעיה מחדש ב-PBS, יש לנתח את התאים תוך שעות, מכיוון שה-DAPI יתנתק לאט לאט מה-DNA, מה שיוביל לאובדן האות.

3. הגדרת ציטומטריית זרימה והרצת דגימות

1. ודא שציטומטר הזרימה מצויד בלייזרים ו/או ערכות מסננים מתאימים למדידת הפלואורופורים המשמשים לצביעה של התאים. ניתן לקבוע זאת תחת תצורת הציטומטר המוגדרת כברירת מחדל במערכת. במקרה של פרוטוקול זה, התאים נותחו באמצעות ציטומטר זרימה המצויד בשלושה לייזרים (405 ננומטר, 488 ננומטר ו-633 ננומטר) המאפשרים זיהוי של ≤ 5 פלואורופורים.
2. בחר את הערוצים המתאימים לזיהוי פלואורופורים מעניינים. כל האותות הפלואורסצנטיים מזוהים בצורה הטובה ביותר עם הגברה לוגריתמית.
3. בחר קצב זרימה מתאים לדגימות. פרמטר זה יכול להשתנות בהתאם למערכת המשמשת ויש לקבוע אותו באופן אמפירי. במקרה של פרוטוקול זה, נעשה שימוש בקצב זרימה של MED-to-HI (35-60 מיקרוליטר לדקה) כדי למנוע סתימת המחט.
4. בחר את המספר הכולל של אירועים/תאים שיש לאסוף לכל דגימה. מספר האירועים המינימלי צריך להיות 1,000,000.
5. צור תרשימי פיזור תחת גליון עבודה גלובלי של אזור הפיזור הצדדי (SSC-A) לעומת אזור הפיזור הקדמי (FSC-A), כמו גם עבור כל פלואורופור מעניין לעומת FCS-A. צור תצוגה סטטיסטית שתציג את מספר האירועים ואת עוצמת הפלואורסצנט הממוצעת (MFI) עבור הפלואורופורים שנבחרו.
6. הגדר את המתח של ערוצי FSC-A ו-SSC-A, כך שהתאים הקטנים ביותר יתאימו ל-10% השמאליים התחתונים של עלילת הפיזור. קבע את הקרינה ברקע ואת הקרינה המינימלית של הדגימה מהפקדים הלא מוכתמים מהעצבים הסיאטיים או מה-DRG. קבע את שער האב (P1) על סמך תרשים הפיזור מבקרות צביעה של DAPI בלבד.
   הערה: זה לא שער איסוף, בין השאר בשל האופי ההטרוגני של אוכלוסיית DAPI+ במערכת העצבים ההיקפית (PNS).
7. באמצעות עלילות הפיזור של FSC עבור כל אחד מהפלואורופורים המעניינים, התאם את המתחים כך שתאי הבקרה הלא מוכתמת ייפלו ברבע התחתון של חלקות הפיזור שלהם. לאחר מכן נוצרים שערים מעל אזור זה כדי להגדיר את התאים החיוביים לכל אחד מהסמנים / הפלואורופורים המתאימים. מיקום השער מאושר על ידי הפעלת הבקרה המוכתמת היחידה (שלב 2.1).
   הערה: פיצוי על ספקטרום פליטה חופף יכול להתבצע בשלב זה או להחיל רטרוספקטיבית עם תוכנת הניתוח המתאימה.
8. לאחר הגדרת ציטומטר הזרימה, כמתואר, ניתן להפעיל את הדגימות.
9. לאחר הריצה, ניתן להשליך את חומר הדגימה שנותר, ולייצא את קבצי ה-FCS להמשך ניתוח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
C57BL/6 עכבר	צ'ארלס ריבר	C57BL/6NCrl
DMEM (+1g/L גלוקוז, גלוטמין, פירובט)<	31885023	מקור החומר הזה אינו חשוב
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
אלבומין סרום בקר (BSA)<	A2153
סוג קולגנאז 4	Worthington Biochemical Corp., US	LS004188
Deoxyribonuclease (DNase) I מלבלב בקר I	Sigma-Aldrich	DN25-1g
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)	Sigma-Aldrich	E6758
סרום עגל עוברי (FCS), חום מושבת	Sigma-Aldrich	F4135
נוגדן נגד CD11b-PerCP/Cy5.5	Biolegend	101228	שיבוט M1/70
נוגדן נגד MHC class II, biotinylated	Biolegend	107603	שיבוט M5/114.15.2
נוגדן נגד CD45-A647	Biolegend	107603	שיבוט 30-F11
Streptavidin-PE/Cy7	Biolegend	405206	משמש לזיהוי MHCII-biotin עם CD45-A647 ו-CDllb-PerCP/Cy5.5
Streptavidin-PerCP	Biolegend	405213	משמש לזיהוי MHCII-biotin עם CD68-APC ו-F4/80-PE/Cy7
Triton-X 100	Sigma-Aldrich	T8787
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542-1MG	דילול ב-PBS ל-50x ו אחסן ב-4 מעלות צלזיוס בחושך
מסננת דיסוציאציה של תאים - ערכת מטחנת רקמות	Sigma-Aldrich	CD1
V-shape, 96-well plates	Greiner/Sigma	M8185
5ml polystryene עגול-תחתון, 12x75 מ"מ	BD Biosciences	352008
60x15mm petri dish	Greiner/Sigma	Z643084
BD LSR II ציטומטר זרימה	BD Biosciences

td style='צבע:#1a202c;גודל גופן:12pt;גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'>Thermotd style='color:#1a202c;גודל גופן:12pt;גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;'>Sigma-Aldrich