בסרטון זה, אנו מדגימים את השימוש בטומוגרפיה קוהרנטית אופטית בתחום ספקטרלי (SD-OCT) כדי לדמות שכבות רשתית ולהעריך שינויים מבניים במודל עכבר מהונדס גנטית עם נוירופתיה אופטית.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
הדמיה in vivo של רשתית העכבר באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית
1.4K צפיות
⸱
29 במאי 2025
במאמר זה
תקציר
פרוטוקול
כל ההליכים הקשורים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים וועדת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. הכנת עכבר
- {{}}התרחבות עיניים וקיבוע
- לפחות 15 דקות לפני איסוף הנתונים, יש להחדיר 10% טיפות עיניים פנילפרין לעיני העכבר, להסיר את העודפים, ולהחדיר 0.5% טיפות עיניים טרופיקמיד.
הערה: ניתן לבצע את ההרחבה הראשונה בבת אחת עבור כל העכברים שייבדקו בסשן. וודאו שהנוזלים בטמפרטורת החדר. - מיד לאחר השראת הרדמה כללית (שלב 1.2), יש לתת טיפות עיניים 0.4% אוקסיבופרוקאין הידרוכלוריד, ולהשאיר אותן במקומן למשך 3 שניות כדי להרדים ולשתק את העיניים. לאחר מכן, נגב את הטיפות וחזור על החדרת 10% פנילפרין ו-0.5% טרופיקמיד כדי לוודא שהעיניים מורחבות היטב.
הערה: יש לוודא שהנוזלים בטמפרטורת החדר ושהעכבר אינו בולע את האוקסיבופרוקאין.
- לפחות 15 דקות לפני איסוף הנתונים, יש להחדיר 10% טיפות עיניים פנילפרין לעיני העכבר, להסיר את העודפים, ולהחדיר 0.5% טיפות עיניים טרופיקמיד.
- הרדמה כללית
- הכינו תמיסת הרדמה של קטמין (20 מ"ג/מ"ל) וקסילזין (1.17 מ"ג/מ"ל) במי מלח. יש לאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך שבועיים לכל היותר.
- כ -5 דקות לפני הבדיקה, יש להזריק תוך צפקית 5 - 10 מיקרוליטר של תמיסת הרדמה לכל 1 גרם מסת גוף, תלוי בגיל ובגודל העכבר.
הערה: עכברים צעירים ו/או רזים זקוקים לפחות חומרי הרדמה, לוקח פחות זמן להרדים, אבל גם מתעוררים מהר יותר. כאן, 8 מיקרוליטר / גרם (160 מ"ג / ק"ג קטמין, 9.33 מ"ג / ק"ג קסילזין). - לחלופין, יש לשמן את העיניים עם טיפות עיניים צמיגות או ג'ל עיניים כדי למנוע יובש בקרנית.
2. מיקום עכבר
- } יש לשמן את העיניים בטיפות עיניים צמיגות על בסיס גליקול כדי לספק לחות בקרנית.
הערה: אם העיניים נראות יבשות במהלך הבדיקה, יש למרוח שוב את טיפות העיניים. - עטפו את העכבר בדף גזה כירורגי כדי לשמור על חום.
- בעזרת ספוג או פתיל כותנה, מרחו שכבה דקה של ג'ל עיניים עם 0.3% היפרומלוז על כל עין, כדי למזער את שבירת האור, למנוע אטימות ולהבטיח לחות בקרנית. תוך כדי כך, הזיזו את הריסים והשפם הצידה.
- מקם את העכבר בקלטת, כשהראש ישר ומצביע קדימה.
- פתח בעדינות את מהדק מוט הנשיכה והנח את המוט בפה; השתמש ברצועת האף כדי לאבטח את המיקום.
הערה: ודא שסרגל הנשיכה נמצא באמצע הקסטה. - הניחו גליל צמר גפן מתחת לצד ימין (שמאל) אם העין הימנית (השמאלית) נבדקת.
- תוך שמירה על קצה הכיוון של הקליפס בעדשה הספציפית לעכבר, הבא אותו לכיוון העין על ידי סיבוב בורג מתרגם Z נגד כיוון השעון.
- על ידי סיבוב וסיבוב הקסטה ועל ידי סיבוב מוט הנשיכה וברגי מתרגם ה-X, הגדר מראש את מיקום העכבר; המטרה היא שהעין הימנית תסתכל ישירות לתוך העדשה, וכך ליישר את הצירים האופטיים של העיניים והעדשה.
הערה: אם העכבר גבוה מדי או נמוך מדי, יש להשתמש תחילה בבורג מתרגם Y. - בחר את הסריקה הראשונה ב"בחינה", לחץ על "התחל לכוון", ובצע התאמות ידניות נוספות להדמיית רשתית.
- באמצעות בורג מתרגם Z, הזז את הרשתית אנכית בלוח השמאלי (} איור 1, יישור אופקי של סריקת B) ואופקית בלוח הימני (} איור 1, יישור אנכי של סריקת B).
- סובב את הקסטה כדי להביא את ה-ONH באמצע הפאנל הימני על ידי הזזת ה-ONH למעלה או למטה. השתמש בבורג מוט הנשיכה כדי ליישר את הרשתית בפאנל הימני. סובב את הקסטה כדי למקם את ה-ONH באמצע הפאנל השמאלי.
- השתמש בבורג מתרגם ה-X כדי ליישר את הרשתית בפאנל השמאלי. תוך התחשבות בפונקציה העיקרית של כל מודולטור, התאם עוד יותר את מיקום הרשתית כדי לרכז את ה-ONH.
הערה: השתמש בבורג מתרגם Y כדי להזיז את ה-ONH למעלה ולמטה בחלונית הימנית, במידת הצורך. ניתן לחדד את המיקום בכל עת בין הסריקות.
3. הדמיית SD-OCT של ה-ONH והרשתית
- {{}}לאחר שתסכים עם ההתאמות, לחץ על "התחל תמונת מצב" כדי להתחיל בסריקת SD-OCT.
- אם אין צורך בהדמיה תלת-ממדית, בטל את הסימון באפשרות OCU.
- שמור את הסריקה ואת הדוח.
- המשך לסריקות הבאות.
- כדי לצלם את העין השנייה, לאחר נסיגת העדשה, סובב את הקסטה בהתאם וחזור על שלבים 2.6 - 3.3.
4. השלמת רכישה
- בסיום הרכישה, יש להוציא את העכבר מהקלטת, למרוח ג'ל עיניים עם 0.3% היפרומלוז על כל עין, ולהניח את העכבר על צלחת חימום כדי להתעורר.
- לאחר הרכישה האחרונה, סגור את התוכנה וכבה את המחשב ואת מכונת ה-OCT (כפתור אספקת החשמל).
- נקה את הקסטה עם חומר חיטוי.
5. ניתוח
- למדידת עובי שכבת הרשתית, השתמש בתוכנת הפילוח האוטומטית שסופקה על ידי היצרן.
- לחץ על "מטופל", בחר את ה"בחינה" הרצויה מהרשימה ולחץ על האפשרות "סקירת בחינה".
- טען את נתוני ה-OCT הרצויים לתוכנת OCT על ידי לחיצה ימנית על סמל התיקייה בסריקה הרצויה.
- לחץ לחיצה ימנית על סריקת B; הגדר את הקליפרים על ידי הפעלת עד 10 קליפרים מדידה; והזן את השמות, הזוויות והצבעים שלהם.
- בחירת הקליפר הרצוי על ידי לחיצה ימנית על סריקת B; הנח אותו בהתאם על הרשתית למדידה.
הערה: עבור הסריקות הממוקדות ב-ONH, הגדר 5 מחוגה בכל צד שלו, במרחק שווה זה מזה. לצורך הניתוח ההיקפיאלי, ודא שהקליפר אינו ממוקם רחוק מדי מה-ONH. לסריקה רדיאלית, נתח 10 תמונות לכל סריקה שנבחרו על ידי תוכנת OCT. ניתן למצוא את מספריהם בתיקיית "דוחות". - שמור את התוצאות לניתוח בתוכנת גיליון אלקטרוני על ידי לחיצה ימנית על סריקת B ולחיצה על "שמור תוצאות".
הערה: ניתן למצוא את התוצאות באותה תיקייה שבה נמצאים נתוני הסריקה.
- לחלופין, השתמש במאקרו קליפר תוצרת בית, "MRI Retina Tool", שפותח עבור תוכנת עיבוד תמונה בקוד פתוח (ראה טבלת החומרים).
- ודא שפקודות המאקרו "MRI Retina Tool" ו-"Modify Polygon Section Tool" פעילות. טען את התמונה. לחץ על כפתור m כדי להתחיל במדידה.
הערה: המאקרו יוצר אוטומטית קלטת מדידה אחת באורך 0.2 מ"מ משני צידי ה-ONH. כל קסטה מכילה 5 נקודות מדידה המתפקדות כמחוגה. המיקום הרוחבי שלהם אינו ניתן לשינוי ומותאם אישית לפריפפילה בסריקות הרדיאליות. המיקום האופקי של הקלטות מוגדר מראש למדידת עובי RNFL/GCL, אך ניתן לשנות אותו בקלות למדוד את השכבה המורכבת GC במקום זאת. אם איכות הסריקה ירודה, יש לכוונן את המיקום האופקי, או להוציא את התמונה מהניתוח. - להתאמה אופקית, לחץ על כפתור e. בחלון "מנהל החזר ההשקעה" שנפתח לאחרונה, בחר את הקסטה הראשונה.
- לחץ על כפתור המצולע הכחול והתאם את מיקום הקסטה הראשונה על ידי לחיצה על גבולות השכבה הנמדדת בתמונה.
- חזור על הקלטת השנייה על ידי בחירתה תחילה בחלון "מנהל החזר ROI" ולאחר מכן לחיצה על התמונה המתאימה. לחץ על כפתור r כדי למדוד מחדש. הצג את התוצאות בחלון "מדידות".
הערה: ניתן להעתיק את התוצאות לתוכנת גיליון אלקטרוני בכל עת. הם מכילים את הערכים הבאים עבור הקסטה הימנית (r), הקסטה השמאלית (l) והסה"כ: Intden - צפיפות משולבת בתוך הקסטה; שטח: שטח המדידה, במ"מ 2; לן: אורך הקליפר בתוך הקסטה, במ"מ; ממוצע: עוצמה ממוצעת של האות בתוך הקסטה; ו-Std: שגיאת תקן של העוצמה הממוצעת של האות. - המשך עם התמונה הבאה.
- ניתוח נוסף של הנתונים בתוכנת גיליון אלקטרוני.
הערה: כדי למצוא את העובי הממוצע של השכבה, קח את עשרת ערכי Len.
- ודא שפקודות המאקרו "MRI Retina Tool" ו-"Modify Polygon Section Tool" פעילות. טען את התמונה. לחץ על כפתור m כדי להתחיל במדידה.
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| Mice | |||
| Opa1delTTAG mouse | - | עכברי דפיקה של Opa1 הנושאים מוטציית OPA1 c.2708_2711delTTAG על רקע C57Bl6/J | |
| Equipment | |||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System | - | ||
| EnVisu R2200 SD-OCT Imaging System Software< | |||
| ImageJ 1.48v | תוכנה לניתוח, דורשת הורדה והתקנה של שתי פקודות מאקרו ביתיות: http://dev.mri.cnrs.fr/projects/imagej-macros/wiki/Retina_Tool | ||
| צלחת חימום עם ויסות עצמי | הגנה מפני היפותרמיה | ||
| Supplies | |||
| Gauze pads 3"x3" | |||
| Dual Ended Cotton tip applicator | - | ||
| Cotton Twists | T.7979C.CS | מיקום עכבר | |
| ריאגנטים ותרופות | |||
| Néosynéphrine Faure 10% | |||
| Mydriaticum 0.5% | |||
| Cebesine 0.4% | 3192342 | ||
| Imalgene 1000 | |||
| Rompun | ROM001 | הרדמה כללית, שיכוך כאבים, הרפיית שרירים | |
| NaCl 0,9% | |||
| Systene Ultra | |||
| GenTeal' | |||
| Aniospray Surf 29 |
