הדמיית זמן-lapse של נדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח בפרוסות מוח עובריות של עכבר

תקציר

Source: Wiegreffe, C., et. al., הדמיה קונפוקלית של נוירונים נודדים בתרבית פרוסה אורגנוטיפית של מוח עכבר עוברי באמצעות In Utero Electroporation. J. Vis. Exp. (2017)

סרטון זה מדגים מיקרוסקופיה קונפוקלית של זמן-lapse כדי לצפות בנדידה רדיאלית של נוירונים בקליפת המוח מהאזור התת-חדרי לצלחת קליפת המוח באמצעות פיגומי גליה רדיאליים בפרוסות מוח עובריות של עכבר.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לביקורת אתית של בעלי חיים.

1. הדמיית זמן-lapse

1. {{}}
   1. הגדר תא אקלים הממוקם על במה של מיקרוסקופ קונפוקלי הפוך לאטמוספירה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. השתמש בגלאי היברידי כדי להפחית את עוצמת הלייזר ולשפר את כדאיות התאים. לניתוח מפורט, השתמש במטרה יבשה של מרחק עבודה ארוך במיוחד פי 40 עם צמצם מספרי של 0.6 ומעלה.
      הערה: כל רכיבי המיקרוסקופ צריכים להיות מחוממים מראש ל-37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 שעות לפני ההדמיה כדי לספק מיקוד יציב במהלך תהליך ההדמיה.
2. הדמיית פרוסות
   1. בחר פרוסת מוח להדמיה מלוח 6 הבארות שמכיל את הממברנה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
      זהירות: הימנע מחשיפה ממושכת לאור אולטרה סגול מכיוון שהדבר עלול לגרום לנזק לאור התא.
      הערה: בחר פרוסה עם נוירונים בודדים בהירים ב-SVZ העליון (אזור תת-חדרי) הנודדים רדיאלית לעבר פני השטח הפיאליים של הפרוסה. תהליכים פלואורסצנטיים עדינים של תאי גליה רדיאליים המשתרעים על פני כל ה-CP (צלחת קליפת המוח) מצביעים על פיגום גליה רדיאלי שלם, המשמש נוירונים בקליפת המוח הנודדים רדיאלית.
   2. העבירו את תוספת הממברנה עם הפרוסה, שנבחרה להדמיית זמן-lapse, לכלי תחתון זכוכית בקוטר 50 מ"מ המכיל 2 מ"ל מדיום תרבית פרוסות בעזרת מלקחיים. הכניסו את המנה לתא האקלים של המיקרוסקופ הקונפוקלי.
   3. הגדר את הרזולוציה ל-512 על 512 פיקסלים והגדל את מהירות הסריקה מ-400 הרץ ל-700 הרץ על מנת להגדיל את קצב הפריימים מכ-1.4 לכ-2.5 פריימים לשנייה, בהתאמה. השתמש בממוצע לא יותר מפעמיים. הגדר מחסנית z דרך האזור האלקטרופוטרי (בדרך כלל 400-100 מיקרומטר) בגודל צעד של 1.5 מיקרומטר. באופן קולקטיבי, הגדרות אלה מאפשרות רזולוציה ובהירות מספיקות של התמונה תוך שמירה על נזק נמוך במהלך הרכישה. התחל את סדרת קיטועי הזמן על ידי לקיחת מחסנית z כל 30 דקות.
      } הערה: חשיפה ממושכת של הפרוסה לאור לייזר תגרום לנזק פוטולוגי ותפחית את הכדאיות של התאים. התאם את זמן החשיפה לאור לייזר בהתאם.
   4. נתח סדרות דולג זמן באמצעות תוכנת ImageJ (https://imagej.nih.gov/iij/) או שוות ערך.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
צלחת 6-בארות	Corning	351146
מיקרוסקופ תרבית רקמה פלואורסצנטי הפוך	Leica	DM IL LED
קונפוקלי מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי	Leica	TCS SP5II
גלאי היברידי	Leica	HyD
אובייקטיבי, 40x/0.60 NA	Leica	11506201
Microscope temperature control system	Life Imaging Services	Cube, Brick & Box
הכנסת תרבית תאים	Millipore	PICM0RG50
Microgrinder	Narishige	EG-45	השתמש בזווית של 38° לשיפוע
microinjector	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III
פינצטה עם אלקטרודות דיסק פלטינה 5 מ"מ	Sonidel	CUY650P5
Micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
חוט תיבה	Sutter Instrument	FB255B	2.5 מ"מ x 2.5 מ"מ
מרית מיקרו-כפית	VWR	231-0191	185 מ"מ x 5 מ"מ
צלחת תחתונה מזכוכית, 50 מ"מ	World Precision Instruments	FD5040-100