אבלציה סלקטיבית של לייזר חד-נוירון בזחל דג זברה באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי

תקציר

מקור: Morsch, M., et. al., הפעלת מתח ומוות של תאים באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של לייזר UV קונבנציונלית. J. Vis. Exp. (2017)

בסרטון זה, אנו בוחנים את הטכניקה של אבלציה בלייזר UV בעוצמה גבוהה למיקוד מדויק ולימוד של נוירונים בודדים בדג זברה טרנסגני. אנו מדגימים כיצד להכין, לשתק ולדמיין תגובות עצביות, תוך הדגשת הדינמיקה התאית של פציעה והתאוששות.

פרוטוקול

1. הכן פתרונות להטמעת דג זברה באגרוז.
   1. הכן תמיסת הרדמה על ידי הוספת 4 גרם/ליטר MS222 (תמיסת מלאי טריקאין, pH 7.0) טיפה לצלחת פטרי המכילה מי ביצים. מינון של 50 מ"ג/ליטר הוא נקודת התחלה מומלצת (איור 1A).
   2. הכינו מלאי של אגרוז נמס נמוך (0.8 - 1.5%) במי ביצים והעבירו אותו לצינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מ"ל. מניחים אליקוט בגוש חום שחומם מראש (38 - 40 מעלות צלזיוס) ונותנים לו להתייצב לטמפרטורה שנקבעה (~ 30 דקות; איור 1B).
   3. אופציונלי: להדמיה לטווח ארוך יותר (> 4 שעות), הכינו עיגול אגרוז קטן בתוך צלחת הפטרי עם תחתית זכוכית בגודל 35 מ"מ והניחו לו להתייצב.
      NOTE: צעד נוסף זה היה יעיל בהימנעות מכל תנועה של כל טיפת האגרוז עם דג הזברה לאורך מסגרות זמן ארוכות יותר.
      1. כדי לעשות זאת, הניחו ~ 300 מיקרוליטר של אגרוז לאורך העיגול הפנימי של צלחת תחתית הזכוכית כדי להכין עיגול בצורת סופגנייה עם פתח קטן באמצע שבו ניתן להניח את הדג (שלב 1.5.3).
2. הרכיבו את דג הזברה באגרוז למיקרוסקופיה.
   1. בחר 1-3 מהדגים שהוקרנו מראש לאבלציה והרדמת הזחלים על ידי העברתם (באמצעות פיפטת העברה) לתוך צלחת עם תמיסת ההרדמה (שלב 1.4.1; איור 1C; כ-5 דקות).
      NOTE: הדגים מורדמים כאשר הם מראים תנועה אופרקולרית רדודה וקצב לב מופחת ואינם מציגים עוד תגובת בריחה מעוררת מגע (TEER; כישלון לשחות משם לאחר נגיעה עדינה בזנבם עם מברשת). הקפידו על הרדמה מתאימה לטיפול האתי בדגים וכדי למנוע עוויתות בעת העברתם לאגרוז או חשיפה לאור פלורסנט.
   2. לאחר אישור ההרדמה, מצצו זחל באמצעות פיפטה מתכווננת (עם קצה חתוך של 200 מיקרוליטר המוגדר ל-~ 30 מיקרוליטר) ותנו לו לשקוע לתחתית הקצה. העבירו את הזחל לאגרוז שחומם מראש (שלב 1.4.2) על ידי שחרור טיפה של הנוזל עם הזחל לתוך האגרוז (נסו למזער את כמות מי הביצים שנכנסות לאגרוז; איור 1D).
   3. תמצוץ את הדג מוקף באגרוז. הוציאו אותו במהירות לכלי 35 מ"מ עם תחתית זכוכית שהוכנה בעבר.
   4. השתמש במיקרוסקופ חיתוך ובמברשת צבע רגילה (תוחם ארוך, גודל 1) כדי למקם את החיה בתוך האגרוז בצד (הראש שמאלה) כך שהגוף והזנב יהיו שטוחים (איור 1E). אם עובדים עם מספר דגים, יישר את כל הדגים בצלחת כך שניתן יהיה לאתר אותם בקלות באמצעות המיקרוסקופ הקונפוקלי מאוחר יותר.
      NOTE: בצע במהירות הליך זה של מיקום ויישור (זה עשוי לדרוש תרגול מסוים, מכיוון שהאגרוז מתחיל להתייצב מיד לאחר חשיפה לטמפרטורות קרות יותר).
   5. השאירו את הדג המוטבע באגרוז למשך 10 - 15 דקות עד שהאגרוז מתייצב היטב. מלאו בזהירות את צלחת הפטרי בגודל 35 מ"מ ב~ 2 מ"ל של מי ביצים המכילים טריקאין (איור 1F).

2. הגדר את המיקרוסקופ הקונפוקלי ופרמטרי ההדמיה

1. הנח את צלחת הפטרי עם הזחל המוטבע על במת המיקרוסקופ הקונפוקלי והתמקד בצד הגבי של חוט השדרה של החיה (באמצעות שדה בהיר). בחן את החיה תחת ההגדלה המתאימה (40X) והגדרת הפלואורסצנט ודמיין את מבנה העניין (למשל, עוצמת הקרינה של הנוירונים המסומנים או תנועת המיקרוגליה) כדי לאשר שכל פרמטרי ההדמיה הם כפי שנדרש לאבלציה הבאה (איור 2). אנו משתמשים באופן שגרתי ביעד 40X כדי לבצע את מחקרי ה-Time lapse שלנו.
2. אופציונלי: כדי לבצע מחקר זמן-lapse במשך מספר שעות, רצוי לתעד נקודת זמן בודדת או כמה נקודות זמן לפני האבלציה כדי לבסס את התגובה הפיזיולוגית הבלתי מופרעת של התא וסביבתו (למשל, תנועת microglial כדי לקבוע מהירות ותנועתיות בסיסית).
3. קבע את עובי המבנה המעניין עבור אבלציה בלייזר UV.
   1. באמצעות כונן z, אמת את החלק העליון והתחתון של המבנה המעניין (למשל, the cell soma) על ידי מיקוד ידני למעלה ולמטה. רשום לעצמך את מישור ה-z שיבוטל (למשל, מרכז התא).
      NOTE: מניסיון, שיטה זו הייתה יעילה ביותר על ידי התמקדות בנוירונים של חוט השדרה שסומנו בבהירות (יחס אות לרעש גבוה המאפשר הדמיה קלה של זמן-lapse לאחר אבלציה; למשל, איור 4) ועל ידי הסרת אמצע סומת התא. פלואורסצנציה של גרעין התא יכולה להיות יתרון כדי להבטיח מיקוד נכון ויעילות אבלציה גבוהה.

3. בצע אבלציה ממוקדת בלייזר של תאים בודדים בדג הזברה חוט השדרה

הערה: עבור גישת אבלציה והדמיה זו, נעשה שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי (Leica SP5). הליך האבלציה באמצעות דיודה של 405 ננומטר להרס ספציפי לתא מפורט על פי התוכנה (Leica Application Suite, v2.7.3.9723). עם זאת, כל מיקרוסקופ קונפוקלי קונבנציונאלי המצויד בלייזר 405 ננומטר ומודול FRAP (התאוששות פלואורסצנטית לאחר פוטו-הלבנה) או אקונומיקה יאפשר ביצוע של אותן מניפולציות תאים, אך פוטנציאלית עם הגדרות, פרמטרים ושמות שונים במקצת.

1. הפעל את אשף FRAP על ידי לחיצה על התפריט הנפתח בחלק העליון של תפריט התוכנה (איור 3A, 1 ו-2). התבונן בחלון חדש עם שלבים שונים המאפשר להגדיר את הפרמטרים הספציפיים לאבלציה בלייזר (איור 3B, 3).
2. קבע את פרמטרי התמונה עבור גישת האבלציה על ידי בחירת התבנית, מהירות הסריקה (איור 3B, 4), וממוצע (איור 3B, 5). פורמט תמונה של 1,024 x 1,024 במהירות סריקה של 400 הרץ וממוצע קו של 4 היה הרלוונטי ביותר.
   NOTE: בדרך כלל אין צורך לשנות את הזיהוי הספקטרלי (כגון פרמטרי העירור או הפליטה), כפי שנקבעו ברכישה הקודמת.
   1. אם מישור ה-z לאבלציה עדיין לא נבחר (כמתואר בשלב 2.4.), לחץ על כפתור "Live" והתמקד דרך הדגימה עד שהמבנה הפלואורסצנטי או מישור ה-z הרצוי שהולך להימחק יהיה בפוקוס.
3. לאחר הגדרת הפרמטרים הכלליים של התמונה, גש לשלב "אקונומיקה" (איור 3C, 6) כדי לשלוט ברכיבי האבלציה הספציפיים.
   NOTE: A שילוב של עוצמת הלייזר (איור 3C, 8), מהירות הסריקה והממוצע שהוגדר בשלב 3.2 (איור 3B, 4 ו- 5), וכן מספר החזרות שיוגדרו בשלב 3.5 (איור 3E, 12), יקבע את זמן השהייה הכולל של לייזר ה-UV בהחזר ה-ROI, ולכן, את יעילות ההלבנה.
   1. הפעל את הלייזר 405 ננומטר על ידי הפעלתו להליך ההלבנה (איור 3C, 8).
      NOTE: ההצלחה הגדולה ביותר עם ההגדרות הנ"ל הושגה עם עוצמות לייזר של 405 ננומטר בין 60 ל-80% במערך הניסוי שלנו. שים לב שתפוקת כוח לייזר זו היא ספציפית למכשיר ותהיה שונה עבור כל הגדרה קונפוקלית.
   2. השתמש באפשרות "התקרבות" (איור 3C, 7) כדי למקסם את עוצמת ההלבנה בהחזר ה-ROI שנבחר על ידי הפחתת שדה הסריקה, ובכך למקסם את זמן השהייה. לחלופין, השתמש באפשרות "נקודת אקונומיקה" של התוכנה הנבחרת לתהליך זה.
4. בחר החזר ROI אחד או יותר (איור 3D, 10) לאבלציה באמצעות כל אחד מכלי הציור בחלון רכישת התמונות (איור תלת-ממד, 9). כוון לגבעת האקסון, למשל, עם כלי הציור המעגלי של כ-4 - 8 מיקרומטר.
   NOTE: אזור האבלציה ניתן לכוונון מפיקסל בודד לאזור גדול יותר, בהתאם ליישום.
5. לאחר קביעת ההחזר על ההשקעה, בחר בלחצן "מסלול זמן" (איור 3E, 11) ולאשר את מספר המחזורים שהחזר ה-ROI ייסרק/יימחק (איור 3E, 12). בחר את המסגרות "טרום הלבנה" ו"לאחר הלבנה" כרצונך כדי לאפשר סקירה כללית של התמונה כולה ממש לפני ומיד לאחר תהליך ההלבנה.
6. לאחר קביעת כל פרמטרי האבלציה הדרושים, לחץ על "הפעל ניסוי" (איור 3E, 13) ולפקח על יעילות האבלציה.
   NOTE: בהגדרת ה-FRAP שלנו, תמונה בודדת תצולם לפני ואחרי מחזור ה-FRAP עם עירור הלייזר המתאים (למשל, עירור של 488 ננומטר עבור תאים המבטאים EGFP). תמונות אלה לפני ואחרי האבלציה מאפשרות שיפוט מהיר של עד כמה החזר ההשקעה הולבן בצורה משביעת רצון ועד כמה יעילים היו פרמטרי האבלציה שנבחרו.
7. חזור על התהליך על ידי התאמת עוצמת הלייזר (איור 3C, 8), מהירות סריקה וממוצע (איור 3B, 4 ו-5), וחזרות (איור 3E, 12) למקרה שהחזר ה-ROI שנבחר עדיין מראה עוצמת פלואורסצנטיות גבוהה לאחר השלמת ה-FRAP מחזור.

תוצאות

חומרים