כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.
1. כיול PET/CT והגדרת זרימת עבודה (6 ימים לאחר ניתוח dMCAO)
- צור זרימת עבודה של הדמיה בתוכנת הפעלת הסורק כדי לכלול רכישת הנחתה של CT, רכישת PET דינמית של C-11 תוך 60 דקות (אפליה ברמת 350 - 650 keV, חלון צירוף מקרים של 3.438 ns), היסטוגרמה (20 פריימים: 5 x 15 שניות, 4 x 1 דקות, 11 x 5 דקות; עם תיקון זמן מת) ושחזור 3DOSEM-OP (2 איטרציות, 18 תת-קבוצות) ליצירת תמונות בגודל 128 x 128 x 159 עם גודל ווקסל של 0.776 x 0.776 x 0.96 מ"מ.
- בצע מיזוג מקור רנטגן באמצעות לוח כיול ה-CT הממוקם בפינה השמאלית העליונה של הממשק. כיול זה חייב להתבצע מדי שבוע או לפני הסריקה אם המערכת לא הייתה בשימוש ב-48 השעות האחרונות.
- בצע כיול כהה/בהיר (D/L) והיסט מרכזי (C/O).
- לחץ על לחצן כיול ה-CT (X) בפינה השמאלית העליונה של הממשק.
- בחר D/L ו-C/O עבור קובץ ה-CT שתפעיל, הסר את המיטה מהשער והפעל את כיול D/L.
- הכנס את מיטת כלי הכיול לסורק והפעל את כיול ה-C/O, הקפד להעביר את הבחירה בממשק ל"כלי כיול" במקום "לוח 70 מ"מ".
- הסר את כלי הכיול והחזר את מיטת ה-PET הסטנדרטית, הקפד לשנות את הבחירה בממשק בחזרה ל"לוח 70 מ"מ".
- אבטחו מיטת הדמיה של 4 עכברים על פלטפורמת הסורק באמצעות סרט הדבקה וחברו את צינור ההרדמה (איור 1A). ודא שאיזופלורן זורם דרך הצינורות ושאין קיפולים.
- דחוף את המיטה קדימה כך שתהיה במרכז שדה הראייה (FOV), סגור את דלת ה-CT וקבל מבט צופה של ה-CT כדי לוודא שהמיטה נמצאת במיקום הנכון.
- בצע כיול "סטנדרטי" של סורק ה-PET/CT באמצעות פנטום המיוצר בחברה המכיל מינון ידוע של תמיסת C-11 כמקור קרינה.
- הכן מזרק של 20 מ"ל מלא במינון העוקב השווה לזה הניתן לעכבר אחד (~250 - 350 μCi/9 - 13 MBq של עוקב C-11 מדולל במי מלח).
- רשום את הפעילות בתקן באמצעות כיול מינון ושים לב לזמן המדידה.
- בצע סריקת PET/CT של התקן תוך שימוש באותם פרמטרים בדיוק שישמשו להדמיית עכברים (כמתואר לעיל). עשה זאת מדי שבוע כדי ליצור גורם תיקון עבור סורק ה-PET שיחול על נתוני ההדמיה.
2. הגדרת סביבת עבודה להדמיית PET/CT
- צור סביבה סטרילית על ידי שימוש בחומר חיטוי עם וירוסיד (ראה טבלת חומרים) והנחת ריפוד סופג מגן על כל המשטחים.
- ודא שמיכלי איזופלורן וחמצן מלאים כראוי.
- הכן צנתרים לוורידי הזנב על ידי מילוי מזרק של 1 מ"ל (מצויד בקצה מחט של 27.5 גרם) ב-0.9% נתרן כלורי (מי מלח סטריליים) ושטיפה דרך קטטר פרפר 27.5 גרם, 24 ס"מ. חתכו את כנפי הקטטר לפני הקנולציה כדי לוודא שהן לא חוסמות את הראייה של וריד הזנב וכדי לעזור להעביר את העכברים בקלות לתוך הסורק מבלי לעקור את הקטטר.
- ודא שכל הציוד החיוני מונח בתחנת העבודה, כולל מזרקי "שטיפה" רזרביים (מלאים במי מלח סטריליים), חומר סיכה לעיניים, ספוגיות אתנול, מנורות חום, צנתרים מוכנים (ממולאים מראש במי מלח), סרט כירורגי, דבק רקמות, מזרקים במינון 0.5 מ"ל, מספריים ומצית לאיטום קטטר לאחר מיקום מוצלח בווריד הזנב (איור 1B).
3. הכנה וקנולציה של בעלי חיים
- שקלו עכברים כדי לקבוע את הנפח המקסימלי המותר להזרקה לכל עכבר (, כלומר, נפח העוקב וכל מי מלח הניתנים לא יעלה על 10% ממשקל הגוף).
- להרדים עכברים בתא אינדוקציה באמצעות 3% איזופלורן ולשמור על 1-2% (2 ליטר לדקה 100% O2).
- מרחו חומר סיכה לעיניים על כל עכבר ואשרו את ההרדמה באמצעות רפלקס דוושה (צביטת בוהן). התאם את רמות ההרדמה במידת הצורך.
- הנח את העכבר על מיטה מחוממת המצוידת בקונוס אף כדי לספק איזופלורן ב-1-2% (2 ליטר/דקה 100% O2).
- בזמן שהעכבר מורדם, בצע צינורית וריד הזנב באמצעות הפרוטוקול הבא:
- {{}} הנח את העכבר על צדו כדי לחשוף את אחד הוורידים הצדדיים, בעוד הראש נשאר בחרוט האף.
- מחממים את הזנב באמצעות מנורת חום, נזהרים לא לחמם יתר על המידה או לשרוף את הזנב, וספוג עם מגבון אלכוהול כדי להרחיב את הווריד ולעקר את מקום ההזרקה.
- החזק את המחט עם השיפוע כלפי מעלה ויישר אותה עם הווריד בזווית חדה.
- הפעל לחץ קל כדי לנקב את העור וליישר את המחט כך שתהיה בקו אחד עם הווריד.
- דחף בעדינות קדימה כמה מילימטרים מעבר לשיפוע כך שהמחט תיכנס לווריד.
- ודא שהקטטר נכנס על ידי מתן שטיפה קטנה (10-20 מיקרוליטר) של מי מלח. מי המלח צריכים לעזוב את המזרק בצורה חלקה והווריד צריך להתבהר. אם נצפתה התנגדות כלשהי או לחץ גב, סביר להניח שהקטטר אינו בווריד ומומלץ לנסות שוב קנולציה. אם נצפתה קרישה, השתמש בהפרין (1,000 יחידות הפרין למ"ל מלח) להגדרת קנולציה ושטיפה.
הערה: הערכנו קנולציה עם ובלי הפרין בזן העכבר המעניין, ומכיוון שלא נצפתה קרישה, נעשה שימוש במי מלח בלבד לקנולציות. - אבטח את הקטטר לזנב באמצעות טיפה קטנה של דבק רקמות, ואחריה סרט כירורגי, כדי להבטיח שהקטטר יישאר ללא תנועה בעת העברת העכברים לסורק.
- הסר את מזרק ההדחה מקצה הצנתר ואטום את הקצה במצית, וודא שהחוקר אינו נמצא ליד איזופלורן או אתנול.
- חזור על הפעולה עבור 3 עכברים נוספים כך שכל 4 העכברים שייסרקו יוכנו ויוכנו.
- הפעל את זרימת ההרדמה (2.5% איזופלורן, 2 ליטר לדקה 100% O2) המחוברת ל-PET/CT ומקם בזהירות את העכברים המועדים במיטת הסורק, וודא שהצנתרים נשארים במקומם וראשו של כל עכבר ישר ומאובטח בתוך חרוט האף. הדביקו את ראשו וגופו של כל עכבר למיטה בעזרת סרט כירורגי רך, כדי להבטיח שהנשימה אינה מוגבלת על ידי מיקום הסרט. רשום את המיקום של כל עכבר כדי לאפשר מיקום נכון והקצאת קבוצה לניתוח תמונה.
- שמור על עכברים מחוממים לאורך כל ההליך ( למשל, באמצעות מנורת חום או מערכת משאבת אוויר חם כדי להבטיח שהעכברים יישמרו חמים ללא התחממות יתר). עקוב אחר קצב הנשימה של כל העכברים, בין אם באופן ויזואלי אם משתמשים בשער פתוח או באמצעות מערכת ניטור מרחוק באמצעות רפידות נשימה, ושנה את רמות ההרדמה לפי הצורך.
4. רכישת CT
- {{}}ברגע שבעלי החיים בטוחים במיטה והנשימה יציבה, הפעילו את שערות הלייזר והזיזו את מיטת הסריקה כך שיתיישרו עם המוח של כל ארבעת העכברים. העבר את מיטת הסורק למצב הרכישה (עמדה 3) כאשר מוחות העכברים קרובים ככל האפשר למרכז ה-FOV.
- רכוש תמונת תצוגת צופים של העכברים כדי לאמת את מיקומם (השתמש ב-FOV של 200 מ"מ), והתאם את המיקום על ידי גרירת תיבת ה-FOV בממשק במידת הצורך. לחץ על "התחל זרימת עבודה" בתוכנת הסורק כדי להתחיל את סריקת ה-CT, הקפד לבחור "הצג הנחיות משתמש אינטראקטיביות" כך שניתן יהיה להתחיל את סריקת ה-PET באופן ידני לפני הזרקת המעקב.
5. [11C]תכשיר מינון DPA-713
- }{{}}TAG_341}}11C]DPA-713, ודא שאתה לובש PPE (ציוד מגן אישי) מתאים לטיפול ברדיואקטיביות, כולל חלוק מעבדה, כפפות ומדי מינון אישיים של האצבעות והגוף. הקפד להחליף כפפות באופן קבוע כדי למנוע זיהום רדיואקטיבי, והגדל את המרחק מהמקור הרדיואקטיבי במידת האפשר.
- השתמש במלקחיים כדי להעביר בזהירות את בקבוקון הרדיו מאחורי מגן עופרת.
- הכן מזרקים במינון של 0.5 מ"ל לכל עכבר המכילים כ-250-350 μCi/9-13 MBq בנפח 100-200 מיקרוליטר כדי להבטיח מינון מתאים לסריקת PET דינמית של 60 דקות (יש לקבוע את המינון הניתן בהתחשב במחצית החיים של האיזוטופ וציר הזמן של תכנון המחקר, כאשר הנפח תלוי במשקל העכבר).
- מדוד את הפעילות באמצעות כיול מינון המוגדר ל-C-11, הממוקם בסמיכות לאתר הקנולציה, ורשום את זמני המדידה וההזרקה כדי לאפשר תיקון עששת. ערכו את המינונים ממש לפני סיום ה-CT כדי להגביל את הדעיכה ולהבטיח שרמת הרדיואקטיביות הרצויה תוזרק לכל עכבר.
- ודא שאין בועות אוויר במזרק המינון לפני מדידת הפעילות והזרקה לכל עכבר.
6. רכישת PET
- לאחר שהעכברים מתקדמים אוטומטית מ-CT ל-PET, הגדירו את החלק האחורי של הסורק עבור [11C]הזרקת DPA-713 (איור 1C). הניחו ריפוד סופג מגן על מדף וודאו שהמספריים והמצית נמצאים בהישג יד.
- גזור את צינור הקטטר האטום במספריים, בדוק שקווי הצנתר נקיים מכל בועות, וודא שהצינורית עדיין בתוך הווריד על ידי ביצוע שטיפת מי מלח של 10-20 מיקרוליטר. טען את מזרקי המינון הנמדד משלב 5.4 לכל אחד מארבעת הצנתרים, תוך מעקב אחר המינון שניתן לכל עכבר.
- לחץ על "אישור" כאשר סריקת ה-PET מוכנה להתחיל תוך הפעלת טיימר של 10 שניות בו-זמנית. בקשו משני חוקרים בחלק האחורי של הסורק עם מזרקי המינון ביד, כדי להזריק את כל 4 העכברים בו זמנית כאשר הטיימר מגיע לאפס. שטפו כל קטטר ב-50-100 מיקרוליטר של מי מלח (תלוי באורך צינור הצנתר — כלומר, הנפח המת) כדי לוודא שהמינון המלא נכנס לווריד הזנב, ואטום מחדש את הצינור שוב באמצעות מצית.
- מדוד את מזרקי המינון באמצעות כיול מינון כדי לקבל ערך רדיואקטיבי שיורי (כל עוקב שנותר במזרק). שים לב לערכים ולזמן שבו הם נרשמים.
- לאחר השלמת הסריקה, החזר את מיטת ה-PET למצב המקורי באמצעות כפתור "הבית" האופקי בלוח בקרת התנועה. הוצא את העכברים מהסורק והסר בזהירות את הצנתר. הפעל בעדינות לחץ על מקום הקנולציה כדי למנוע דימום מוגזם.
- מדוד את הפעילות השיורית בצנתר באמצעות כיול מינון.
- אם רוצים לשחזר עכברים, יש לוודא שזה נעשה בסביבה חמה (, למשל, בקופסה עם כרית מחוממת מתחתיה או מכילה כפפה מלאה במים חמים) כדי להקל על ההתאוששות. אם מתכננים להמית את העכברים, הכניסו את העכברים לתא אינדוקציה המכיל איזופלורן כך שהם יישארו מורדמים לפני המתת חסד באמצעות זלוף.
- כדי לשחזר את הנתונים, פתחו את תוכנת הניהול לאחר העיבוד (ראו טבלת החומרים), אשר תשחזר אוטומטית כל סריקה באמצעות נתוני ההיסטוגרמה שנוצרו מקובץ ה-lst.
7. ניתוח תמונות PET דינמי
1. פתח תוכנה לניתוח תמונות (ראה טבלת חומרים) ולחץ על סמל "נתונים פתוחים" כדי לטעון את תמונת ה-CT (כמקור) ועל סמל "צרף נתונים" כדי לטעון את ה-PET הדינמי (כסימוכין).
2. בצע בקרת איכות חזותית של הנתונים באמצעות אופרטור סדרות הזמן בתפריט הנפתח: בחר הפניה ("ref") ו"גלובלי" והחל מינימום ומקסימום מתאימים עבור סולם הצבעים. דמיין את נתוני ה-PET הדינמיים מסגרת אחר מסגרת, מאמת את קליטת הרדיואקטיביות ובודק אם יש בלבולי תנועה בתוך הסריקה.
{{}}3. צור תמונת PET ממוצעת באמצעות "האופרטור האריתמטי".
1. בחר "ממוצע נבחר", בטל את הבחירה ב-"ref", וודא שקלט 1 ("Inp1"), קלט 2 ("Inp2") וכוכב קלט ("Inp*" - כולל את שאר מסגרות ה-PET בסריקה) נבחרו כדי ליצור ממוצע של כל מסגרות ה-PET.
2. עבור לכרטיסייה "מנהל נתונים" (DM) וגרור את התמונה הממוצעת למעלה למיקום "input1" למטרות הדמיה. הפץ מחדש את קנה המידה של הצבעים על ידי לחיצה על החישוב האוטומטי בכלי "מינימום-מקסימום".
4. רשום את ה-CT ל-PET הממוצע file באמצעות הפונקציה "תלת מימד אוטומטי" בתפריט הנפתח "כיוון מחדש/רישום".
1. בחר "ref" ו-"Inp1", ובחר רישום "קשיח", "מהיר", "Inp1 to Ref". בדוק חזותית את הרישום בכל 3 הממדים והתאם ידנית במידת הצורך בכרטיסייה "תלת מימד ידני" באמצעות הפונקציות "תרגום" ו"סיבוב".
2. כאשר אתה מרוצה מהרישום, בחר "Inp2" ו-"Inp*", והחל על כל מסגרות ה-PET על ידי לחיצה על סימן הביקורת. לחץ לחיצה ימנית על קבצי ה-CT וה-PET ב-DM ושמור כגולמי.
5. חתוך את המוח של עכבר אחד בכל פעם לניתוח מוח באמצעות ה-CT כמדריך: בחר "חיתוך" מהתפריט הנפתח וגרור את גבולות התמונה כדי לחתוך את ראש העכבר מתחת לגזע המוח. כיוון מחדש את תמונות ה-PET וה-CT באמצעות הפונקציה "כיוון מחדש תלת מימד ידני" כמתואר לעיל כך שהגולגולת תהיה ישרה בכל הממדים.
6. טען את תמונת ה-MR עבור אותו עכבר (בפורמט DICOM) באמצעות כפתור "צרף נתונים" בפינה השמאלית העליונה של הממשק. הזז את ה-MR באמצעות "כיוון מחדש תלת מימדי ידני" והתאם לגולגולת בתוך תמונת ה-CT (ודא שכל השיטות נמצאות באותו כיוון).
7. צייר את החזר ה-ROI של הקו על תמונת ה-MR באמצעות "כלי החזר ROI תלת מימדי".
1. כבה את הדמיית ה-PET על ידי ביטול הבחירה בה בלשונית הבקר החזותי (VC) והשתמש רק ב-MR וב-CT כדי לצייר את ההחזר על ההשקעה.
2. לחץ על כפתור "הוסף החזר ROI" כדי ליצור החזר ROI חדש ולקרוא לו "infarct". בחר ב"כלי ספליין", לחץ לחיצה ימנית כדי לצייר את גבול ההחזר על ההשקעה ולחץ באמצעות לחצן העכבר הימני כדי לסגור אותו.
3. חזור על כל הפרוסות המקיפות את השבץ, הקפד לא ללכוד אף אחת מהגולגולת בהחזר ההשקעה, כאשר השיטה הטובה ביותר היא להשאיר מרווח ווקסל בין גבול הגולגולת לבין החזר ה-ROI של השבץ.
8. צור החזר ROI נגדי באמצעות נפח האוטם.
1. צור החזר ROI חדש ותייג אותו "קונטרה-צדדי". לחץ לחיצה ימנית על החזר ה-ROI של האוטם ובחר "ייצוא". גרור את החזר ה-ROI למיקום 2 ("Inp1").
2. כאשר רק "Inp1" נבחר, החל היפוך ימינה שמאלה באמצעות הפונקציה "אופרטור" בתפריט "כיוון מחדש/רישום". סמן את התיבה "ROI", בחר "תצוגה בלבד", והעבר ידנית את החזר ה-ROI החדש לאזור זהה בצד הנגדי. בחר את האופרטור "אריתמטיקה" והחל כפל סקלרי של 2 על ה-ROI החדש, המאפשר כימות עצמאי של החזר ה-ROI.
3. חזור לכלי החזר ROI תלת מימדי. עבור לכרטיסייה "מומחה וניסיוני" ולחץ על כפתור "ייבוא החזר ROI". בחר Inp1 מתיבת הדו-שיח כדי לטעון את אמצעי האחסון החדש כהחזר ה-ROI הנגדי.
9. לחץ לחיצה ימנית על תמונת ה-PET הממוצעת ופרוק אותה והפעל שוב את ה-PET. צור את תוצאות הקליטה הכמותית באמצעות סמל "ייצוא תוצאות" בכלי החזר ההשקעה בתלת-ממד.
10. בצע ניתוח מוח מפוצל נוסף במידת הצורך (כלומר, יצירת החזר ROI אוטומטי של אזורי המיספרה של המוח הימני לעומת השמאלי באמצעות מודול תוסף אטלס מוח עכבר תלת מימדי עבור תוכנת Vivoquant).
1. טען מחדש את תמונות ה-PET/CT הרשומות.
2. ייבא את אטלס המוח של העכבר על ידי לחיצה על תפריט "מודולים מתקדמים" ובחירה בכלי אטלס המוח התלת מימדי. בחר "כל האזורים שמאל/ימין" ב"הגדרות מתקדמות" ולחץ על "הפעל" כדי לייבא את אטלס התלת מימד.
3. התאם ידנית את האטלס בתוך המוח תוך שימוש בגולגולת כגבול.
4. הפעל מחדש את האטלס וודא ש"ייבוא החזר ROI תלת מימדי" נבדק כדי ליצור גיליון אלקטרוני של תוצאות עבור כל 14 החזר ההשקעה של ההמיספרה השמאלית והימנית (מדולה, מוח קטן, מוח אמצעי, פונס, קליפת המוח, היפוקמפוס, תלמוס, היפותלמוס, סטריאטום, פלידום, נורות ריח, קורפוס קלוסום וחומר לבן).
11. כימות קליטת העוקבים בטחול באמצעות תוכנת ההפעלה של הסורק (ראה טבלת חומרים).
1. טען קבצי תמונות PET ו-CT על ידי הדגשתם במסד הנתונים ולחיצה על "ניתוח כללי".
2. לחץ על לשונית ההרשמה והרשמה משותפת של תמונות PET ו-CT תוך לחיצה על סמל "רישום קשיח".
3. לחץ על הכרטיסייה כימות החזר ROI, לחץ על הסמל "צור החזר ROI" ותן לו שם טחול.
4. בחר בכלי "כדור" כדי לצייר החזר ROI של הטחול באמצעות קובץ ה-CT לעיון, וודא שאין חפיפה עם ספיגת הכליות (שימוש בתמונת ה-PET ובאות כדי למנוע זליגה מהכליות).
5. ערוך את החזר ה-ROI כדי לשמור על נפחי החזר ROI עקביים בין בעלי חיים.
12. חישוב ערך תיקון סטנדרטי לנורמליזציה של קליטה.
1. טען את נתוני ה-PET/CT מהסריקה הסטנדרטית וצור החזר ROI צילינדר המקיף את מזרק 20 מ"ל באמצעות הכלי "החזר ROI תלת מימדי ידני".
2. השג את רמת הרדיואקטיביות הכלולה בתקן באמצעות סמל הגיליון האלקטרוני.
3. השתמש בתוצאת nCi/cc זו וברדיואקטיביות המוקלטת המקורית עבור התקן (כלומר, מדידת כיול המינון של התקן ב-nCi/cc) כדי ליצור גורם תיקון לערכי קליטת PET. כלומר, חלקו את הרדיואקטיביות של התקן שנרשמה על ידי כיול המינון ברדיואקטיביות המחושבת מתמונת ה-PET של התקן.
13. השתמש בפעילויות המינון ובזמן המדידות כדי לדעוך נכון לזמן רכישת ה-PET עבור כל העכברים (כלומר חשב את פעילות המינון בתחילת סריקת ה-PET).
14. חזור על הערכים השיוריים והחסר מהמינון המתוקן של הדעיכה כדי לחשב את הפעילות המדויקת שכל בעל חיים קיבל.
15. לאחר החלת תיקון דעיכה זה, החל גם את התיקון הסטנדרטי כדי לוודא שהנתונים נמצאים ברמת הפעילות הנכונה. ודא שהתיקונים הללו מיושמים על תוצאות ה-ROI שצוירו ידנית, ונתוני ה-ROI של אטלס המוח הרלוונטיים למיקום dMCAO (כלומר, קליפת המוח, ההיפוקמפוס והסטריאטום).
16. חשב את %ID/g עבור כל ההחזר על ההשקעה באמצעות המשוואה הבאה: %ID/g = (רדיואקטיביות ROI ב-nCi/cc / מינון מתוקן דעיכה שהתקבל ב-nCi/cc) x100. התווה %ID/g כפונקציה של זמן באמצעות תוכנת גרפים כדי ליצור עקומות פעילות זמן עבור כל החזר ROI.
17. השתמש בתוכנת סורק להדמיית תמונה סופית ויצירת דמויות. נרמל תמונות בהתאם למינון מתוקן הדעיכה שקיבל כל עכבר בזמן הסריקה, וודא שכל התמונות יהיו באותו קנה מידה %ID/g.
הערה: זה הכרחי כדי לאפשר השוואה מדויקת של תמונות מעכברים שונים ו/או תמונות ממחקרים שנערכו בימים שונים.