ניטור מורפולוגי ופיזיולוגי של ספרואידים גידוליים באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית

תקציר

מקור: }Huang, Y. et. al.,, ניטור מורפולוגי ופיזיולוגי אורכי של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול באמצעות טומוגרפיה קוהרנטית אופטית. J. Exp. (2019)

}{{}}} סרטון זה מדגים את השימוש בקוהרנטיות אופטית טומוגרפיה (OCT) לניטור ספרואידים של גידול בצלחת מרובת בארות על ידי לכידת תמונות חתך ברזולוציה גבוהה. על ידי ניתוח השתקפויות אור ממבנים תאיים, OCT בונה מודלים תלת מימדיים כדי להעריך תכונות מורפולוגיות כמו גודל וצורה תוך הבחנה בין תאים ברי קיימא לתאים שאינם ברי קיימא על סמך שינויים בפיזור האור לאורך זמן.

פרוטוקול

1. הכנת תאים

1. }השג שורות תאים מספק מוסמך.
   הערה: ודא שתאים מקווי התאים המעניינים יכולים ליצור ספרואידים במצע התרבית או בעזרת מצע (מטריצת ממברנה בסיסית כמו מטריגל). עיין בספרות או בצע סבב אחד של ניסוי מקדים לבדיקה.
2. הפשירו את התאים הקפואים בהתאם לנוהל הספציפי שסופק על ידי ספק קו התאים. נוהל כללי ניתן למצוא במקום אחר.
3. תרבית התאים עבור 1-2 קטעים ב-25 ס"מ²{{}} צלוחיות תרבית. לאחר מכן התאים מוכנים לשימוש לתרבית תאים תלת מימדית.
4. יש לעקוב אחר מצב בריאות התאים מדי יום ולשמור אותם באינקובטור בתנאים סטנדרטיים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO₂, 95% לחות). רענן את המדיה לפי הצורך.
   הערה: מדיום התרבית מורכב ממדיום הנשר המותאם של דולבקו (DMEM) (4.5 גרם/ליטר גלוקוז), 1% אנטיביוטיקה-אנטי-פטרייתית, ו-10% סרום בקר עוברי (FBS). תאי תת-תרבות לפני שהם מגיעים למפגש בבקבוק התרבית. פעל לפי הנחיות תרבית התאים שסופקו על ידי הספק. נוהל כללי ניתן למצוא במקום אחר.
5. בצע תרבית תאים תלת מימדית בצלחות מרובות בארות על סמך הפרוטוקול הכללי הבא.
   1. הסר את אמצעי התרבות מבקבוק התרבות ושטוף אותו בתמיסת מלח מעוקרת עם חוצץ פוספט (PBS, מחומם ל -37 מעלות צלזיוס).
   2. השעו מחדש את התאים על ידי הוספת 1 מ"ל של חומצה טריפסין אתילנדיאמין-טטראצטית (EDTA, 0.5%) לבקבוק למשך 3 דקות. לאחר מכן, הוסף מדיה תרבותית כדי לדלל את הטריפסין.
   3. העבירו את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה בנפח 15 מ"ל וצנטריפוגה למשך 5 דקות בטמפרטורה של 500 x g וטמפרטורת החדר.
   4. הסר את הסופרנטנט והשהה מחדש תאים עם 4 מ"ל של מדיום תרבית שחומם מראש. פיפטה טיפה אחת של הדגימה על המוציטומטר לספירת תאים כדי לקבוע את ריכוז התאים. לדלל את התאים לריכוז המתאים לזריעה ( למשל , 3,000 תאים/מ"ל).
      הערה: מטב את ריכוז התאים ההתחלתי של הספרואיד עבור כל שורת תאים וכל סוג של צלחת מרובת בארות (96 בארות, 384 בארות או 1536 בארות).
   5. תאי זרעים לצלחת רב-בארות עם תחתית עגולה (ULA) עם תחתית עגולה. הוסף 200 מיקרוליטר של תרחיף תאים לכל באר בריכוז של 3,000 תאים/מ"ל כך שבכל באר יהיו כ-600 תאים.
   6. בטמפרטורת החדר (RT), צנטריפוגה את כל הצלחת באמצעות מתאם צלחת למשך 7 דקות, מיד לאחר הזריעה, במהירות של 350 x g או המהירות הנמוכה ביותר שיש.
      הערה: הצנטריפוגה עוזרת לאסוף תאים למרכז הבאר כדי להקל על יצירת ספרואיד יחיד ואחיד. שלב הצנטריפוגה מבוצע רק פעם אחת בהתחלה ליצירת ספרואידים של הגידול. זה לא יחזור על עצמו כאשר כדורי הגידול יתחילו לגדול.
   7. שמור על צלחת מרובת בארות ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% CO₂ בחממת תרבות ורענן את מדיית התרבות כל 3 ימים.
      הערה: זמן הצמיחה עשוי להשתנות בתנאי תרבות תלת-ממדיים שונים. במחקר שלנו, 3,000 תאים/מ"ל משמשים הן לשורות תאים U-87 MG והן ל-HCT 116 בצלחות של 96 בארות, כך שהספרואיד יכול לגדול ל-~500 מיקרומטר תוך 4-7 ימים עבור תאי HCT 116. בהתבסס על פרוטוקול התרבות התלת-ממדית הכללי, שקול להוסיף תוספי מדיה וגורמי גדילה עבור מודלים שונים של ספרואידים.
   8. בצע הדמיה של טומוגרפיה קוהרנטית אופטית (OCT) של ספרואידים של גידול כל 3-4 ימים למחקר אורך של צמיחתם.
      הערה: נקודות הזמן המומלצות להדמיית OCT הן יום 4, יום 7, יום 11, יום 14, יום 18 ויום 21.

2. פלטפורמת הדמיית OCT בתפוקה גבוהה

} הערה: ראה } איור 1 לפרטים על מערכת הדמיית OCT המותאמת אישית ששימשה במחקר זה.

1. בחר מקור אור פס רחב מתאים למערכת OCT להדמיית ספרואידים של גידול.
   הערה: כאן, דיודה סופר-זוהרת (SLD, }איור 1A, B) עם אורך גל מרכזי של ~1,320 ננומטר ורוחב פס של 110 ננומטר שימשה כמקור אור בפס רחב.
2. בנה את זרוע הייחוס וזרוע הדגימה של מערכת ה-OCT בהתאם לסכמות (ראה איור 1A, B לפרטים). הטבלה {{}}, } חומרים} מפרטת את הרכיבים האופטיים הדרושים לבניית מערכת ה-OCT. ודא שאורכי הנתיב האופטי של זרוע הייחוס וזרוע הדגימה תואמים היטב.
3. בנה את הספקטרומטר, כולל קולימטור, סורג, עדשת F-theta ומצלמת סריקת קו (ראה איור 1C להגדרה) לפרטים על עיצוב הספקטרומטר של OCT. לחלופין, בחר ספקטרומטר מסחרי התואם את אורך הגל המרכזי של מקור האור. ודא שהספקטרומטר מיושר כהלכה כדי לכסות את כל רוחב הפס של הלייזר, כדי להשיג יעילות גבוהה של איסוף פוטונים וכדי לספק שטיפה איטית של דפוס ההפרעה.
4. אפיינו את הביצועים של מערכת ה-OCT, כולל המדדים הבאים כגון עוצמת זרוע הדגימה, עומק הדמיה כולל, רגישות תלוית עומק, רזולוציה צירית, עומק מיקוד ורזולוציה רוחבית. מקם רפלקטור חלש ( למשל , מראה עם מסנן צפיפות ניטרלי) כדגימה למדידת הרגישות התלויה בעומק, הרזולוציה הצירית ועומק המיקוד. מקם יעד בדיקת רזולוציה של חיל האוויר של ארצות הברית (USAF) כמדגם כדי לבדוק את הרזולוציה הרוחבית.
5. בחר שלב תרגום ממונע כדי לספק תנועה אופקית של הלוח מרובה הבארות כדי לדמות ספרואידים של גידול בבארות שונות (ראה } איור 1B). השתמש ב-tagעם טווח נסיעה גדול מ-108 מ"מ על 72 מ"מ כדי להבטיח סריקה מלאה של כל הבארות של צלחת הבאר הרב-בארית. השתמש בשלב תרגום ממונע דו-ממדי (2D) או תלת-ממדי (3D) עם בקרת תוכנה כדי לאפשר את המיקום המדויק של כל באר ואוטומציה של מערכת OCT להדמיה בתפוקה גבוהה.
6. השתמש במתאם צלחת או עצב מחזיק צלחת (על ידי הדפסת תלת מימד) כדי להחזיק את הצלחת מרובת הבארות במצב קבוע.
7. לפני ביצוע הדמיית OCT כלשהי, תקן את ההטיה והסיבוב של הלוח הרב-באר באמצעות שלב הטיה דו-ממדי ושלב סיבוב המותקן על שלב התרגום (ראה } איור1D) כדי למזער את השונות של מישור המיקוד מבארות שונות. השתמשו ב-D2, D11, B6, D6 ו-G6 כבארות מנחות בעת ניטור מיקומם היחסי בתמונות OCT (איור 1A).
8. התאם את סיבוב הלוח כדי להבטיח שהקצוות מקבילים לכיוון תנועת הבמה כך שהבארות יישארו באותם מיקומים אופקיים בתמונות OCT ( איור 1E). התאימו את הטיית הלוח כך שתהיה מקבילה לטבלה האופטית כך שהבארות יישארו באותם מיקומים אנכיים להדמיית OCT (איור 1F).
   הערה: התאמת זווית ההטיה והמיקוד עוזרת לייעל את איכות התמונה של OCT עבור כל הבארות. עם זאת, שינויים בגובה אמצעי התרבות בבארות שונות עלולים לגרום לשינויים בנתיב האופטי, מה שעלול להוביל לחוסר מיקוד של התמונה הספרואידית. ניתן ליישם מיקוד אוטומטי כדי לשלוט במישור המוקד של הדמיית OCT כדי להשיג איכות תמונה אופטימלית. שלב ההתאמה אינו פותר איכות תמונה ירודה של OCT של ספרואיד הגידול עקב הבעיות הבאות: ירידת הכדור עקב מיקום הזריעה הראשוני; הגבהה ספרואידית כאשר היא מוטמעת במטריצות חוץ-תאיות מיוצרות ביולוגית; איכות צלחת ירודה עם וריאציות גדולות של גובה תחתית הבאר. ניתן ליישם בקרת תוכנה נוספת עם פונקציות מיקוד אוטומטי או יישור עצמי כדי לייעל את הביצועים של מערכת ההדמיה OCT.
9. כדי לאסוף נתונים מכל באר ברצף, תוכנת מחשב מותאמת אישית שולטת ברכישת תמונת OCT ובתנועת הבמה.

3. OCT סריקה ועיבוד של ספרואידים של גידול

1. ביום הדמיית OCT של ספרואידים של גידול, הסר את צלחת הבאר הרב-בארית מהאינקובטור. העבר אותו מתחת למערכת ההדמיה OCT והנח אותו על גבי מתאם לוחית הרישוי.
   הערה: ניתן לבצע הדמיית OCT של ספרואידים של גידול עם מכסה לוחית הפוליסטירן מופעל או כבוי. עם זאת, עיבוי המים על המכסה עקב אידוי מהבארות עלול להשפיע על העברת האור ולעוות את נתיב האור, ולהניב תמונות OCT פחות אופטימליות מהספרואידים.
2. התאם את גובה הצלחת על ידי תנועה לאורך כיוון ה-z של שלב התרגום. שמור על מיקום מישור המוקד ב-~100-200 מיקרומטר מתחת לפני השטח העליונים של כל ספרואיד, כדי למזער את ההשפעה של פרופיל המוקד הלא אחיד מבחינת עומק.
3. בתוכנה המותאמת אישית, הגדר טווח סריקת OCT מתאים ( לדוגמה, 1 מ"מ x 1 מ"מ) כדי לכסות את כל הספרואיד של הגידול בהתאם לשלבי ההתפתחות שלו. לחץ על שמור פרמטרים כדי לשמור את ההגדרה.
4. השתמש בתוכנה המותאמת אישית כדי לרכוש תמונות OCT תלת מימדיות של ספרואידים של גידול בזה אחר זה עבור כל בארות הצלחת המכילות ספרואידים. יש ללחוץ על הכפתור Preview כדי להציג את תמונת התצוגה המקדימה וללחוץ על הכפתור } Acquire} כדי להשיג את תמונת ה-OCT.
   הערה: יש לוודא שנתוני ה-OCT נאספים כאשר השלב אינו בתנועה. הכדור ממוקם בדרך כלל במרכז באר ה-U-bottom. עם זאת, הספרואיד עשוי להיות מוסט באמצעי התרבות כאשר השלב מאיץ או מאט עקב האינרציה של הספרואיד באמצעי התרבית.
5. עבד מערכי נתונים OCT תלת מימדיים של ספרואידים של גידול כדי ליצור תמונות מבניות OCT עם קוד עיבוד C++ מותאם אישית. ראה איור 2A לתרשים זרימה של העיבוד שלאחר העיבוד של נתוני OCT.
   הערה: ראה } איור 3A לתמונות המבניות של OCT תלת-ממדיות שנוצרו.
   1. כיול גודל הפיקסלים בכל שלושת הממדים. שנה את קנה המידה של התמונות המבניות של OCT בקנה מידה מתוקן.
      הערה: המרחק בכיוון הצירי (כיוון z) של תמונות OCT מודד את הפרש הנתיב האופטי בין זרוע הייחוס לזרוע הדגימה. לפיכך, יש לקחת בחשבון את מקדם השבירה של המדגם (n) בעת כיול גודל הפיקסלים בכיוון הצירי לשינוי קנה מידה. במחקר שלנו, אנו משתמשים ב-n = 1.37 כמקדם השבירה של ספרואיד הגידול.
6. צור קולאז' של תמונות ספרואידים באמצעות תמונות OCT דו-ממדיות בשלושה מישורי חתך XY, XZ ו-YZ על פני מרכז הספרואיד. ראו איור 4C–E לפלט המייצג של קולאז'ים של תמונות ספרואידיות. בצע רישום תמונה עבור כל הספרואידים, באמצעות הפונקציה MATLAB dftregistration, כדי להבטיח שהמרכזים של כל הספרואידים ממוקמים בערך באותו מיקום.
7. השג עיבוד תלת מימד של הספרואיד באמצעות תוכנה מסחרית או מותאמת אישית.
   הערה: השלבים הבאים מראים כיצד להשיג עיבוד תלת-ממדי של ספרואידים של גידול באמצעות תוכנה מסחרית.
   1. טען את נתוני ה-OCT התלת-ממדיים לתוכנה.
   2. לחץ על החלונית Surpass. לאחר מכן, לחץ על הוסף נפח חדש. בחר במצב }Blend לשימוש לעיבוד תלת-ממד.
   3. התאם את זווית התצוגה על-ידי גרירת התמונה באמצעות מצביע העכבר.

4. כימות מורפולוגי של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול

הערה: קוד שנכתב בהתאמה אישית ב-MATLAB מעבד את הכימות הזה. לחץ על הכפתור הפעל כדי להתחיל את התהליך. ראה איור 2B לתרשים הזרימה של שלבי הכימות המורפולוגי של ספרואידים.

1. כימות קוטר, גובה ונפח מבוסס קוטר ספרואידי.
   1. בחרו תמונות OCT דו-ממדיות בשלושה מישורי חתך XY, XZ ו-YZ החוצים את המרכז של הספרואיד.
   2. מדוד את הקוטר והגובה של הכדור במישורי XY ו-XZ, בהתאמה.
   3. חישוב נפח ספרואיד מבוסס קוטר באמצעות:

, עם הנחה של הצורה הכדורית של הגידול.

2. כימות נפח ספרואיד מבוסס ווקסל.
   1. החילו מסנן ממוצע תלת-ממדי על הנתונים המבניים של OCT של הספרואיד כדי להסיר כתמים.
   2. פלח ספרואידים של גידול באמצעות מסנן זיהוי קצה Canny, מסגרת אחר מסגרת, עם סף מתאים המפריד בין אזור הספרואיד של הגידול לתחתית הבאר.
   3. קבץ ווקסלים לחיבור עבור נתונים תלת-ממדיים (ראה פונקציה מובנית: bwconncomp).
   4. חשב את המרחק הממוצע בין כל ווקסל חיבור בקבוצה לבין המרכז הספרואיד (שנבחר ידנית), עבור כל קבוצה. זהה את האזור הספרואיד כקבוצה עם המרחק הממוצע המינימלי.
   5. ספרו את מספר הווקסלים באזור הספרואיד ולאחר מכן הכפילו בנפח בפועל של ווקסל בודד (נפח/ווקסל), והניבו את הנפח הכולל של הספרואיד.

5. זיהוי אזור תאים מתים של ספרואידים תלת-ממדיים של גידול

} הערה:} בתווך הומוגני, ניתן לתאר את עוצמת ה-OCT המפוזרת לאחור כפונקציה של עומק (I(z)) ניתן לתאר על ידי חוק באר-למברט:

{{}}כאשר z} מייצג את העומק, μ הוא מקדם הנחתה האופטי, ו-I0 היא עוצמת האירוע לדגימה. מכאן שניתן לבטא את מקדם ההנחתה האופטי הנגזר כך:

מכיוון שתמונות OCT משורטטות לעתים קרובות בקנה מידה לוגריתמי, ניתן לאחזר את השיפוע של פרופיל עוצמת ה-OCT כדי לגזור את מקדם ההנחתה האופטי. ראה איור 2C לתרשים זרימה של יצירת מפות ההנחתה האופטיות.

1. בצע פילוח כדי להסיר אזורים לא רצויים מחוץ לספרואיד. בצעו מסנן ממוצע תלת-ממדי כדי להפחית את רעש הכתמים הטבוע בתמונות OCT.
2. השג מקדמי הנחתה אופטיים מבחינת פיקסלים על ידי התאמה ליניארית של פרופיל עוצמת ה-OCT בקנה מידה על פני טווח עומק מסוים (חלון נע), חילוץ השיפוע שלו והכפלת השיפוע ב-1/2.
   הערה: מקדם ההנחתה בכל ווקסל באזור הספרואיד המפולח מחושב על סמך השיפוע של פרופיל עוצמת ה-OCT בחלון עומק של 10 ווקסל (~40 מיקרומטר עומק), כאשר הווקסל ממוקם באמצע החלון.
3. החל את השיטות לעיל (שלבים 5.1 ו-5.2) על כל סריקה צירית במסגרת וכל מסגרת במערך נתונים תלת מימדי המכיל את האזור הספרואיד המפולח עד לחישוב מקדמי הנחתה אופטיים עבור כל הווקסלים של האזור הספרואיד המפולח.
4. בצע את הסף הבינארי כדי להדגיש את אזור ההנחתה הגבוהה.
   סמנו את מפת ההנחתה האופטית הבינארית בתמונה המקורית כדי לסמן את אזור התא המת (מיזוג). צור את התמונה המעובדת בתלת-ממד של מפת ההנחתה הממוזגת כדי להמחיש את ההתפלגות התלת-ממדית של אזור התאים המתים.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מערכת הדמיה OCT מותאמת אישית			פותחה במעבדה שלנו
}דיודה סופר-זוהרת (SLD)	}Thorlabs	SLD1325	}TAG_29{{}}
2×2 מצמד סיבים מותכים במצב יחיד, 50:00 יחס פיצול 50	AC Photonics	WP13500202B201
זרוע התייחסות		{{}} {{}} {TAG_47}}
} שפופרת עדשה	Thorlabs
Thorlabs
} Collimating Lens	Thorlabs	AC080-0220 0-C
} עדשת מיקוד	}Thorlabs
Thorlabs		TAG_99{{}}
{{}}} מראה	Thorlabs	{{}}
1D שלב תרגום	}Thorlabs
Thorlabs		{{}}
	Thorlabs
} מזלג הידוק	}Thorlabs
זרוע לדוגמה
} שפופרת עדשה	Thorlabs
{{}}{{TAG_173 TAG_174}}}Thorlabs
עדשה קולימטית	Thorlabs	AC080-020-C
גלוונומטר	Thorlabs{TAG_195{}}} }}
{{}}} עדשת ממסר	Thorlabs	}AC254-100-C	}שתי עדשות ממסר ליצירת טלסקופ הגדרה
תושבת מראה משולש	Thorlabs	}
}
{{}}	Mitutoyo	}	{{ TAG_239}}
} עמוד הדום	}Thorlabs	}
}מזלג הידוק
}בקר קיטוב	}Thorlabs		{{ TAG_269}}
תושבת כלוב 30 מ"מ	Thorlabs		{{}}
} מוט כלוב
{{}}			{{ TAG_299}}
} שלב תרגום ממונע תלת-ממדי	בייג'ינג מאו פנג אופטואלקטרוניקה טכנולוגיה בע"מ	JTH360XY
}	}	}	}
} שלב סיבוב	} {{TAG_ 325}}
{{}}} מחזיק לוחית			} 3D מודפס
ספקטרומטר			}
} שפופרת עדשה	Thorlabs{{TAG_ 355}}
{{TAG_363 TAG_364}}{{}}Thorlabs
Thorlabs	AC080-020-C	}
	}Wasatch	G = 1145 lpmm
F-theta lens	Thorlabs	FTH-1064-100
מצלמת סריקת קו InGaAs	חיישן ללא הגבלה	SU1024-LDH2
רכיב תרבית תאים{{TAG_ 414}}
HCT 116 קו תאים	ATCC	CCL-247
בקבוק תרבית תאים	SPL מדעי החיים	70025
Pipette	Fisherbrand	14388100
}טיפים לפיפטה	Sorenson Bioscience	10340{TAG_459{}} }}
Gibco GlutaMax DMEM	}Thermo Fisher Scientific	10569044
סרום בקר עוברי, מוסמך, מוצא אמריקאי	}Thermo Fisher Scientific	16000044
}אנטיביוטיקה-אנטימיקוטית (100X)	}Thermo Fisher Scientific	15240062	}
קורנינג 96 באר שקוף תחתית עגולה חיבור נמוך במיוחד מיקרופלייט	קורנינג	7007
Gibco PBS, pH 7.4	Thermo Fisher Scientific	10010023
Gibco Trypsin-EDTA (0.5%)	}Thermo Fisher Scientific	15400054	}
Forma Series II 3110 Water-Jacketed CO2 incubator	}Thermo Fisher Scientific	3120
כפפות	}VWR	89428-750
}Parafilm	Sigma-Aldrich{{ TAG_555}}	P7793
} העברת פיפטות	גלובוס סיינטיפיק	138080
צנטריפוגה	}Eppendorf	5702 R	לצנטריפוגה של צינור 15 מ"ל
}צנטריפוגה{{ TAG_583}}	NUAIRE	AWEL CF 48-R	לצנטריפוגה של לוח 96 בארות
מיקרוסקופ	} אולימפוס
{{}} רשימת OCTs מסחריים
מערכת SD-OCT	Thorlabs	{{}} סדרת טלסטו
{{}}} מערכת SD-OCT	Wasatch Photonics	WP OCT 1300 nm
תוכנה לניתוח נתונים{{TAG_ 637}}
{{}}ניתוח תמונות בסיסי	NIH	}ImageJ	פיג'י עובד גם הוא.
3D Rendering	Thermo Fisher Scientific	Amira	תוכנה מסחרית. אפשרות 1
} עיבוד תלת-ממדי	}Bitplane	}Imaris	תוכנה מסחרית. אפשרות 2. בשימוש בפרוטוקול
תוכנת רכישת OCT	,	,	שפותחה בהתאמה אישית ב-C++.
בקרת שלב	בייג'ינג מאו פנג אופטואלקטרוניקה טכנולוגיה בע"מ	MRC_3	{{}} משולב בקוד הרכישה המותאם אישית של OCT
}תוכנת עיבוד OCT			מותאם אישית שפותח ב-C++. השתמש ב-GPU. משולב בקוד הרכישה המותאם אישית של OCT.
ניתוח מורפולוגי ופיזיולוגי		}	מותאם אישית פותח ב-MATLAB

{{ TAG_62}}מתאם{{TAG_ 92}}הר מראה קינמטי{{ TAG_122}}מסנן צפיפות נייטרלית רציף{TAG_136{ }} {{ TAG_151}}{TAG_166{ }} {{TAG_ 181}}{{{}}{{{ TAG_224}}Thorlabs{{}}{{}} TAG_254 1}}Thorlabs{{}}{{ {TAG_284}}Thorlabs }{{ {TAG_372}}עדשה קולימטית{{TAG_ 386}} {{}} {{}}{{}} {}}}{{TAG_ 473}}{{TAG_510}TAG_511}{{}}{{}}{TAG_540{}}{}} {{}} } }{{ TAG_610}}