הדמיית פוליזומים שבודדו ממוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי

Abstract

Source: Lunelli, L., et. al. הצצה בפוליזומים במוח עם כוח אטומי מיקרוסקופיה. J. Vis. Exp.(2016).

סרטון זה מדגים הדמיה של פוליזומים באמצעות מיקרוסקופ כוח אטומי. יריעת נציץ מצופה יוני ניקל מעגנת RNA עם ריבוזומים מחוברים. הדגימה נשטפת, מיובשת ומותקנת על במת המיקרוסקופ. קצה השלוחה סורק את פני הדגימה, רושם סטיות לייזר כדי למפות את הטופולוגיה. תוכנה משמשת לתיקון עיוותים ולהמחשת מבני פוליזום ברזולוציה גבוהה.

Protocol

זהירות: כדי למנוע פירוק RNA של הדגימות, הכינו את כל המאגרים באמצעות מים שטופלו ב-DEPC כדי למזער את זיהום ה-RNase.

1. הכנת פוליזומים ממוח שלם

1. } איסוף רקמות מוח (15 דקות)
   1. המתת חסד של זן עכבר מסוג פרא C57BL/6 עם CO₂} חנק למשך 5 דקות. נתחו בזהירות את המוח מהגולגולת, הניחו את הרקמה בצינור של 1.5 מ"ל והניחו אותה מיד בחנקן נוזלי. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש.
2. הכנת ליזאט (30 דקות)
   1. לרסק את כל רקמת המוח באמצעות מכתש ועלי מתחת לחנקן נוזלי.
   2. העבירו כ-25 מ"ג אבקה לצינור מיקרו-צנטריפוגה קר ומיד (כדי למנוע הפשרת הרקמה המרוסקת) הוסיפו 0.8 מ"ל של מאגר ליזה ( ראו טבלה 1) ושבשו את התא על ידי פיפטינג למעלה ולמטה 25 פעמים במהירות.
   3. צנטריפוגה את הצינור ב-12,000 x גרם למשך דקה אחת ב-4 מעלות צלזיוס כדי לגלול פסולת סלולרית.
   4. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש והשאירו את הצינור על קרח למשך 15 דקות.
   5. צנטריפוגה של הצינור ב-12,000 x g למשך 5 דקות ב-4 מעלות צלזיוס לגרעיני גלולה ומיטוכונדריה.
   6. העבירו את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה חדש.
   7. אחסן את הסופרנטנט בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס למשך 6 חודשים לכל היותר או השתמש בו מיד.
3. הכנת שיפוע סוכרוז וצנטריפוגה (שעתיים ו-30 דקות)
   1. }יש לשטוף את צינורות האולטרה-צנטריפוגה באופן נרחב במים נטולי RNase (מים מטופלים בדיאתילפירוקרבונט (DEPC-water) או מסחריים) ו-3% H₂O₂/DEPC H_{2{{TAG_ 126}}}O solution.
   2. שים את הצינורות על קרח והוסף 5.5 מ"ל של תמיסת סוכרוז קרה 50% בתחתית כל שפופרת (ראה טבלה 1 לתמיסות סוכרוז). הוסיפו בזהירות את תמיסת הסוכרוז 15% טיפה אחר טיפה, והישארו קרובים לשלב הביניים על מנת לשמור על אינטרפאזה חדה עד למילוי מלא של הצינור. כאשר הצינור מלא לחלוטין, סגור אותו עם פקק גומי כדי למנוע היווצרות בועות אוויר.
   3. בחדר קר הניחו בעדינות את הצינורות אופקית ושמרו אותם במצב זה למשך שעתיים. לאחר זמן זה, יישר לאט את הצינורות בחזרה למצב אנכי והניח אותם על קרח. השיפועים מוכנים כעת לשימוש. לחלופין, הכינו את שיפוע הסוכרוז של 15-50% באמצעות שיפוע קונבנציונאלי לשעבר.
   4. בחדר קר, הסר בזהירות 1.0 מ"ל מהחלק העליון של השיפוע וכסה את הסוכרוז טיפה אחר טיפה עם הליזאט הציטוזולי (כלומר, הסופרנטנט המתקבל בשלב 1.2).
   5. הורד בזהירות את הצינורות לדליים של רוטור הדלי המתנדנד. צנטריפוגה את השיפועים למשך 100 דקות ב-180,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס באמצעות אולטרה-צנטריפוגה.
   6. לאחר הצנטריפוגה, השאירו את הצינורות בדליים שלהם למשך 20 דקות ב-4 מעלות צלזיוס כדי לייצב את השיפועים.
4. פיצול שיפוע סוכרוז (2 שעות)
   1. הסר בזהירות צינור אולטרה-צנטריפוגה אחד מרוטור האולטרה-צנטריפוגה והרכיב אותו על התקן הקולט של מערכת פיצול שיפוע צפיפות. אסוף שברים של 1 מ"ל כדי לנטר את הספיגה ב-260 ננומטר עם גלאי UV/VIS (ראה איור 1 פאנל עליון). שמור את השברים שנאספו על קרח.
   2. הכן ציטוטים של 30-40 מיקרוליטר של שברי העניין. שמור אותם על קרח לפני אחסונם בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד לשימוש. אל תשתמש באליקוטים או בשברי סוכרוז שעברו יותר משני מחזורי הקפאה-הפשרה (ראה איור 1 פאנל תחתון).

2. הכנה לדוגמה למיקרוסקופ כוח אטומי (3 שעות)

1. בעזרת סרט, מקלפים את יריעות הנציץ.
2. שוטפים את דפי הנציץ 3-4 פעמים במי DEPC ומניחים אותם בכלי פטרי קטן. ואז יבש את המשטח באמצעות אוויר.
3. מכסים את הנציץ ב-200 מיקרוליטר של 1 מ"מ NiSO₄ ומדגרים למשך 3 דקות ב-RT.
4. } מסירים את תמיסת הניקל ואז מייבשים את המשטח באמצעות אוויר. בצע את כל השלבים העתידיים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס על ידי הנחת צלחת הפטרי עם הנציץ על קרח.
5. הפשירו אליקוט שהתקבל ב-1.4.2 על קרח והוסיפו בעדינות את כל הדגימה טיפה אחר טיפה לנציץ. בעזרת קצה של 100-200 מיקרוליטר, מורחים את הדגימה על כל פני הנציץ. דגרו את הדגימה על קרח למשך 3 דקות.
6. כסו את יריעת הנציץ טיפה אחר טיפה עם 200 מיקרוליטר Buffer-AFM (ראו {{}}) ודגרו במשך שעה אחת על הקרח.
7. הדמיה בנוזל
   1. הסר בזהירות את מיקרוסקופ הכוח האטומי (AFM) ושטוף את יריעות הנציץ 3-4 פעמים עם 200 מיקרוליטר מאגר-AFM קר כדי להסיר עודפי סוכרוז. לאחר מכן, שטפו את דפי הנציץ 3 פעמים עם תמיסת כביסה קרה (ראו טבלה 1), והשאירו את משטח הנציץ מכוסה בכמה מיקרוליטרים של תמיסה.
   2. עבור לנקודה 3 (רכישת תמונה).
8. הדמיה באוויר
   1. הסר בזהירות את ה-Buffer-AFM ושטוף את הנציץ 3-4 פעמים עם 200 מיקרוליטר Buffer-AFM קר כדי להסיר את עודפי הסוכרוז. לאחר מכן, שטפו את הנציץ 3 פעמים בתמיסת כביסה קרה (ראו טבלה 1) ורוקנו את עודפי המים באמצעות נייר.
   2. השאירו את הדגימה לייבוש מתחת למכסה המנוע הכימי כשהחלק העליון של צלחת הפטרי פתוח חלקית. לאחר שעתיים סוגרים את צלחת הפטרי ומאחסנים אותה בטמפרטורת החדר (RT). מדוד את המדגם לאחר 2-3 שעות, מכיוון שהם יציבים במשך שנים.

3. רכישת תמונה (15 דקות לתמונה לאחר ייצוב תרמי)

הערה: ניתן לצלם פוליזומים המשותקים על נציץ באוויר או בנוזל באמצעות מצב AC.

1. חבר את הנציץ למחזיק הדגימה באמצעות סרט דו צדדי.
2. הכנס את מחזיק המדגם ל-AFM tagה בהתאם להוראות היצרן. בעת הדמיה בנוזל, במידת האפשר, נסה לשמור על הדגימה בטמפרטורה נמוכה מ-25 מעלות צלזיוס כדי להגביר את יציבות הפוליזום בזמן.
3. בחר שלוחה המתאימה להדמיית AC והרכיב אותה על מחזיק הקצה בהתאם להוראות היצרן. כאן, השתמש בשלוחה עם קבוע כוח בין 2-20 N/m להדמיית אוויר וסביב 0.1 N/m להדמיה נוזלית.
4. כוונן את נקודת הלייזר על השלוחה ואפס את אותות גלאי הרבעים.
5. בחר תדר נהיגה מתאים והניע את השלוחה עם משרעת של 10-20 ננומטר.
6. התקרב לדגימה עד שהקצה יתחבר למשטח.
7. בחר אזור סריקה של 2x2 מיקרומטר, קבל תמונות של 512x512 פיקסלים לפחות (רוחב פיקסלים < 4 ננומטר) ובחר מצב חיסור ברקע חי וסולם Z של 20-25 ננומטר.
8. בדוק את התמונה בחיפוש אחר נוכחות של עצמים עגולים המאופיינים בגובה שבין 10 ל -15 ננומטר בעת רכישה באוויר ו -25 ו -30 ננומטר בנוזל והרוחב בטווח 25-30 ננומטר. התאם את נקודת ההגדרה ופרמטרי המשוב עד להדמיית אובייקטים חדים. הרקע אמור להיראות שטוח יחסית בדגימות טובות, עם כמה עצמים בגובה 2-4 ננומטר (ראה איור 2A ו-B).
9. אם התמונה נראית טוב (כפי שמצוין בנקודה 3.8), רכוש מספר (לפחות עשר) סריקות של 2x2 מיקרון באזורי דגימה שונים.
10. (לא חובה). במידת הצורך, רכשו תמונות ברזולוציה גבוהה של פוליזומים נבחרים (ראו }איור 2C).
11. החל תיקוני תוכנה (חיסור מישור ואלגוריתמי תיקון שורה אחר שורה) כדי לתקן את תמונות ה-AFM, תוך הסרת אפקטים שרירותיים של הטיה וסחיפה.

4. ניתוח נתונים (30 דקות לתמונה)

1. {{}}ייצוא תמונות ב-ImageJ (אופציונלי: החלת גורם קנה מידה) בעדיפות באמצעות פורמט דחיסה ללא אובדן, למשל, פורמט TIFF (ראה איור 3A).
2. השתמש בערכת כלי המאקרו ImageJ RiboPick.ijm (להעתקה בתת-ספריית המאקרו/ערכת הכלים של ImageJ) כדי לספור ריבוזומים בפוליזומים (ראה איור 3B) ולחשב מאפיינים סטטיסטיים של המדגם (ראה } איור 3C).
   1. התחל לטעון תמונה באמצעות הכלי <קרא תמונה> שמאתחל את התוכנית.
   2. בחר את מרכזי הריבוזום בעזרת הכלי הסטנדרטי ImageJ <בחירת נקודה> (shift + לחיצה שמאלית מאפשרת בחירה מרובה של ריבוזומים). סמן את הריבוזומים שנבחרו בעזרת הכלי <סמן ריבוזומים>. קואורדינטות ריבוזום יופיעו בחלון טקסט מותאם אישית.
   3. הוסף עוד ריבוזומים לאותו פוליזום, וחזור על ההליך המצוין בנקודה 4.2.2.
   4. הסר ריבוזומים שסומנו באופן שגוי באמצעות הכלי <בטל את הבחירה האחרונה> (התחל להסיר מהריבוזום האחרון שנוסף לראשון - בפוליזום הנוכחי בלבד).
   5. לאחר השלמת הפוליזום, השתמש בכלי <פוליזום חדש>. כאשר מספר הפוליזום מתווסף כשכבת-על לתמונה, חלון הטקסט מתעדכן.
   6. השתמש באפשרות <שמור תוצאות וסגור> כדי לכתוב את קובץ הקואורדינטות של הריבוזום (נעשה שימוש ביחידות ברירת המחדל של התמונה) ותמונת PNG המסכמת את הריבוזומים והפוליזומים שנבחרו. התמונה המקורית נסגרת מבלי להישמר.

טבלה 1. מאגרי.

10 מ"מ Tris–HCl, pH 7.5

מאגר	}TAG_523{{}}	{{}}{{}}}{{}}{ יישום
מאגר ליזה	הכנת ליזאט (1.1)
}	10 מ"מ NaCl	{{TAG_ 577}}
	{{}}10 מ"מ MgCl2
	1% טריטון-X100
	1% נא-דאוקסיכולאט	}
	0. 4 מעכב RNase U/ml
{{ TAG_641}}	1 מ"מ DTT	{{}}
}	0. 2 מ"ג/מ"ל ציקלוהקסמיד	}
	{{ TAG_673}}5 U/ml Dnase I
50% תמיסת סוכרוז{{}}{{}} {}}	50% (w/v) סוכרוז ב	}סוכרוז הכנת שיפוע (1.1.) 2)
	100 מ"מ NaCl {{TAG_717 }}
	10 מ"מ MgCl2{{ TAG_733}}
	10 מ"מ Tris/HCl pH 7.5
15% תמיסת סוכרוז	{{ TAG_764}}15% (w/v) סוכרוז ב	הכנת שיפוע סוכרוז (1.) 2)
	100 מ"מ NaCl	}
10 מ"מ MgCl2
}	{{}}10 מ"מ טריס/HCl pH 7. 5
} תמיסת ניקל	1 מ"מ NiSO4}	{{}} {{}}{הכנה לדוגמה ל-AFM (2)
מאגר-AFM	100 מ"מ NaCl	{{}}}{{ הכנה לדוגמה ל-AFM (2)
{{}}TAG_885	10 מ"מ MgCl2
	100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסמיד{{{}}{{}}{{}}{{}}{{}}100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסמיד{
	10 מ"מ Hepes{{ TAG_924}}
	3% (w/v) סוכרוז pH = 7.4
כביסה פתרון	DEPC-Water	}הכנה לדוגמה ל-AFM (2)
	100 מיקרוגרם/מ"ל ציקלוהקסמיד {{ TAG_985}}

{{ TAG_548}}{{}}{{}}{TAG_594}} {{ TAG_610}}{{ TAG_794}} {{ TAG_824}}

Results

Materials