הדמיה פלואורסצנטית כפולה לזיהוי אוליגודנדרוציטים מובחנים

תקציר

מקור: Schott, J. T., . הכנת תרביות אב של אוליגודנדרוציטים של חולדות וכימות של אוליגודנדרוגנזה באמצעות סריקת פלואורסצנציה אינפרא אדום כפולה. J. Vis. exp. (2016).

}סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיה פלואורסצנטית כפולה כדי להעריך את ההתמיינות של אוליגודנדרוציטים מתאי מבשר (OPCs) שבודדו ממוח של גור חולדות. התהליך כולל קיבוע התאים, תיוג סמנים ספציפיים עם נוגדנים משניים ראשוניים ומצומדים פלואורופור, והדמיה שלהם באמצעות הדמיה פלואורסצנטית. מזוהים אוליגודנדרוציטים מובחנים המבטאים הן את החלבון הבסיסי של המיאלין (MBP) והן את גורם השעתוק של אוליגודנדרוציטים 2 (Olig2), מה שמבדיל אותם מתאי קודמן לא ממוינים המבטאים רק Olig2.

פרוטוקול

1. הכנת לוחות בדיקה, פתרונות מלאי ו-OPC Base Media

note: המדיה של בסיס ה-OPC של החולדה (Sato) המתוארת כאן נגזרה ממחקרים שפורסמו בעבר. ניסוחים של מדיה חלופית עשויים גם הם להיות תואמים להליך זה.

1. השעו מחדש את הפולי-L-ליזין (PLL) לריכוז של 10 מיקרוגרם/מ"ל במים סטריליים נטולי יונים. פיפטה 400 מיקרוליטר של ה-PLL המדולל לכל באר של צלחת בדרגת תרבית רקמות עם דופן שחורה, שקופה 24 בארות.
2. מצפים כלי תרבית רקמה למשך שעתיים באינקובטור תרבית רקמות של 37 מעלות צלזיוס או לילה במקרר של 4 מעלות צלזיוס.
3. יש לשאוב PLL מכלים מצופים לפחות 20 דקות לפני הציפוי. הניחו ל-PLL הנותר להתייבש מהבאר על ידי הנחת 24 צלחות באר כשהמכסה פתוח חלקית במכסה המנוע של תרבית רקמות. ודא שהבארות יבשות לחלוטין לפני ציפוי OPCs מבודדים. תאים לא ידבקו לפלסטיק שיש בו PLL נוזלי.
4. הכן N-Acetyl-L-cysteine (NAC) (NAC) (1,000x): להמיס 100 מ"ג N-Acetyl-L-cysteine (NAC) ב-20 מ"ל של מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM). יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
5. הכן תמיסת מלאי הידרוקורטיזון (פי 1,000): הוסף 1 מ"ל אתנול ל-1 מ"ג הידרוקורטיזון ומערבב להמסה. מוסיפים 19 מ"ל DMEM, מערבבים את התמיסה, מכסים ושומרים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. הוכח כי תוספת של הידרוקורטיזון לאמצעי הבסיס משפרת את הישרדותם של תאי גליה.
6. הכן תמיסת מלאי d-ביוטין (פי 5,000): ממיסים 2.5 מ"ג של d-biotin ב-50 מ"ל של מי מלח עם חוצץ פוספט (PBS). הוסף 1-2 x 5 טיפות מיקרוליטר של 0.1 N NaOH כדי לסייע בהמסה. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
7. הכן תמיסת מלאי אינסולין (פי 100): ממיסים 25 מ"ג אינסולין ב-50 מ"ל מים בדרגת תרבית רקמות. מוסיפים 250 מיקרוליטר של 1 N HCl ומערבבים עד שהתמיסה נקייה. יש לעקר עם מסנן של 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס עד 6 שבועות.
8. הכן פתרון מלאי סאטו (100x):
   1. הכן תמיסת מלאי פרוגסטרון (25 מיקרוגרם/מיקרוליטר): ממיסים 2.5 מ"ג פרוגסטרון ב-100 מיקרוליטר אתנול.
   2. הכן תמיסת מלאי נתרן סלניט (400 ננוגרם/מיקרוליטר): ממיסים 4 מ"ג נתרן סלניט ב-100 מיקרוליטר של 0.1 N NaOH. מוסיפים 10 מ"ל DMEM ומערבבים.
   3. ל-100 מ"ל DMEM, יש להוסיף 1 גרם אפו-טרנספרין אנושי, 1 גרם אלבומין בסרום בקר ו-160 מ"ג פוטרסין ולערבב להמסה מלאה. מוסיפים 25 מיקרוליטר של תמיסת מלאי פרוגסטרון, 1,000 מיקרוליטר של תמיסת מלאי נתרן סלניט ומערבבים. יש לאחסן בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.
9. הכן את מדיית הבסיס של OPC: לכל 100 מ"ל של DMEM (עם 4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, L-גלוטמין ו-110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט), הוסף 100 מיקרוליטר NAC, 100 מיקרוליטר הידרוקורטיזון, 20 מיקרוליטר D-ביוטין, 1 מ"ל אינסולין, 1 מ"ל ציר סאטו, 100 מיקרוליטר יסודות קורט B, 2 מ"ל תוסף B-27 (פי 50) ו-1 מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין (פי 100). יש לעקר עם פילטר של 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.
10. הכינו תמיסת מלאי של גורם גדילה AA (PDGF-AA) שמקורו בטסיות דם (פי 1,000): ממיסים 250 מיקרוגרם ב-12.5 מ"ל PBS עם אלבומין בסרום בקר (BSA) של 0.1% כדי ליצור תמיסה של 20 מיקרוגרם/מ"ל. יש לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
11. הכן מדיית התפשטות OPC: מדיית בסיס OPC בתוספת 20 ננוגרם/מ"ל PDGF-AA.
12. הכן מדיית התמיינות OPC: מדיית בסיס OPC בתוספת טריודותירונין של 45 ננומטר.
13. הכן מאגר עמודים: ל-500 מ"ל PBS, הוסף 2.5 גרם BSA ו-2 מ"ל של 0.5 M חומצה אתילנדיאמינטטראצטית (EDTA) והתאם את ה-pH ל-7.2. יש לעקר עם פילטר של 0.22 מיקרומטר ולאחסן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

2. אינדוקציה של בידול וקיבוע OPC עם 4% Paraformaldehyde

note: כאשר בוחנים את ההשפעה של מולקולות קטנות על אוליגודנדרוגנזה, אנו ממיסים באופן שגרתי תרופות בדימתיל סולפוקסיד (DMSO) כדי להכין מלאי פי 1,000 שניתן לאחסן בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס ולדלל ישירות לתוך מצע SATO כדי לקבל ריכוז סופי של 0.1% DMSO. לא ראינו שינויים בהתפשטות או בהתמיינות של OPC באמצעות ריכוז זה של DMSO (נתונים לא מוצגים).

1. לחמם מראש את מדיית הבסיס של OPC ל-37 מעלות צלזיוס ולהפשיר מלאי לטיפול תרופתי לטמפרטורת החדר. בעת ביצוע טיפולים משוכפלים, הכינו כ-1.25 מ"ל מדיה לכל קבוצת טיפול בשפופרת של 1.5 מ"ל. עבור דגימות משולשות, השתמש בצינורות צנטריפוגה בקיבולת של 2 מ"ל כדי להסביר את הרפיון.
2. הכן את תערובות מאסטר הטיפול לבארות שכפול על ידי דילול מלאי הטיפול ישירות למדיית הבסיס של OPC. מערבולת קצרה או מערבבים בעדינות כל מאסטרמיקס כדי להבטיח פיזור הומוגני של הטיפול.
3. הכן 45 ננומטר triiodothyronine (T₃) כבקרה החיובית והרכב המתאים כבקרה שלילית. דילול 10 מ"מ T₃ מלאי 1:1,000 ב-1 מ"ל של חומר בסיס OPC ולאחר מכן לדלל עוד יותר בתערובת המאסטר לטיפול כדי להפחית את הריכוז הסופי של DMSO במידת הצורך.
4. שאיבת המדיה מבארות התרבית קבוצת טיפול אחת בכל פעם כדי למנוע ייבוש התאים. השתמש בקצה פיפט של 200 מיקרוליטר בקצה פיפט הזכוכית של פסטר כדי למנוע גירוד של חומר שחור מדפנות הבאר לתוך התרבות.
5. מוסיפים לאט לאט 500 מיקרוליטר של תערובת מאסטר טיפולית לאורך דופן הבאר באמצעות פיפט של 1 מ"ל.
6. דגרו את התרביות למסגרת הזמן הרצויה, ובצעו חילופי מדיה מלאים עם מדיה טיפולית חדשה כל 2-3 ימים. אנו צופים באופן שגרתי ב-30-40% MBP⁺ תרבות לאחר 4 ימים ב מדיית בידול.
7. בתום תקופת הטיפול הרצויה, הכינו 4% פרפורמלדהיד טרי (PFA) או הפשירו ציר קפוא לטמפרטורת החדר. זהירות: PFA רעיל ביותר ויש להכין אותו במכסה אדים.
8. שאפו את המדיה והוסיפו לאט לאט 400 מיקרוליטר של PFA לצד הבאר כדי לתקן את התאים. דגרו את הצלחת למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
9. שאפו את ה-PFA והוסיפו לאט לאט 500 מיקרוליטר של מי מלח סטריליים עם חוצץ פוספט של Dulbecco (D-PBS, עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺) לצד הבאר כדי לשטוף את התאים. חזור על הכביסה בסך הכל פעמיים נוספות. אל תשאף את הכביסה הסופית.
10. עטפו את הצלחת בפרפילם ואחסנו בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס לעיבוד מאוחר יותר או המשיכו ישירות לשלב הבא. ניתן לאחסן צלחות למשך מספר שבועות.

3. אימונוציטוכימיה וכימות של חלבון בסיסי של מיאלין

note: בעת ביצוע הליכי טיפול בנוזלים על 24 צלחות הבאר, מומלץ לעבוד מהר כדי למנוע ייבוש התאים. כאן מומלץ להשתמש בשואב ואקום רב ערוצי ובפיפט רב ערוצי.

1. הביאו את הצלחת לטמפרטורת החדר, שאפו את הבארות והוסיפו 250 מיקרוליטר של D-PBS (עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺) המכיל 0.1% Triton X-100 ו-5% סרום עיזים רגיל (NGS). דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם טלטול אורביטלי עדין.
2. הכן את תמיסת הדגירה העיקרית על ידי דילול נוגדן חד שבטי נגד MBP בעכבר 1:1,000 ונוגדנים אנטי-אקטין רב-שבטיים של ארנב 1:200 ב-D-PBS (עם סגנון Ca²⁺ ו-Mg²⁺) המכיל 5% NGS. לחלופין, ניתן להשתמש באנטי-אוליג2 רב-שבטי של ארנב ב-1:1,000 לנורמליזציה ספציפית של אוליגודנדרוציטים בתרביות גליה מעורבות. הכן מספיק תמיסה ראשונית כדי להכיל 250 מיקרוליטר לבאר.
3. דגרו על נוגדנים ראשוניים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה למשך 16-18 שעות עם טלטול אורביטלי עדין.
4. שאפו את תמיסת הדגירה העיקרית ושטפו את התאים 3 x 10 דקות עם 500 מיקרוליטר של D-PBS (עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺) בטמפרטורת החדר עם טלטול מסלול עדין.
5. בזמן שטיפת הצלחת, הכינו את תמיסת הדגירה המשנית על ידי דילול נוגדנים נגד עכבר 680 ואנטי ארנב 800 1:500 ב-D-PBS (עם Ca<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:0.6em;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>²⁺ ו-Mg²⁺) המכיל 5% NGS. צמצם את החשיפה לאור הסביבה בעת הכנת פתרון זה.
6. שאפו את הכביסה הסופית והוסיפו 250 מיקרוליטר של תמיסת דגירה משנית. הגן על הצלחת מפני אור ודגר אותה בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת עם טלטול אורביטלי עדין.
7. שאפו את תמיסת הדגירה המשנית ושטפו את הבארות 3 x 10 דקות עם 500 מיקרוליטר של D-PBS (עם Ca²⁺ ו-Mg²⁺) בטמפרטורת החדר עם טלטול מסלול עדין.
8. סרוק את הצלחת באמצעות מערכת הדמיה המסוגלת לזהות פליטות פלואורסצנטיות של 700 ננומטר ו-800 ננומטר. כנקודת התחלה, הגדר את היסט המוקד ל-3 ואת הרגישויות ל-1.5 עבור MBP, 5.0 עבור אקטין ו-3.5 עבור Olig2. התאם את ערכי הרגישות לפי הצורך כדי למנוע חשיפת יתר של האות.
9. כמת את היקף האוליגודנדרוגנזה באמצעות שיטות מבוססות תוכנה אוטומטיות למחצה.
   1. באמצעות התוכנה, הגדר את מצב ניתוח הלוחות ל-"24 Well" ויישר עיגולים סביב ההיקף החיצוני של הבארות הסרוקות. הגדר את ערוץ הנורמליזציה ל-"800" וייצא את עוצמות הקרינה הכוללות והיחסיות עבור ערוצי 700 ננומטר (MBP) ו-800 ננומטר (Olig2/Actin).
   2. חלקו את העוצמה ב-700 ננומטר בעוצמה ב-800 ננומטר כדי לתת את ביטוי ה-MBP המנורמל ביחידות פלואורסצנטיות יחסיות. חשב את הממוצע של מדידות שכפול ושנה את קנה המידה של הביטוי לפקדי Day 0 +PDGF לפי הצורך לניתוח.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
Culture Materials
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/mL
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 mL
Triiodothyronine <	T6397	45 nM
Clemastine fumarate salt	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
מלח Quetiapine hemifumarate	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-acetyl cysteine	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/mL
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/mL
Poly-L-lysine	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/mL
Putrecine	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/mL
נתרן סלניט	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/mL
Hydrocortisone	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/mL
d-Biotin	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/mL
Insulin	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/mL
Apo-Transferrin	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/mL
Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/mL
Trace Elements B	Corning	25-022-Cl	1 x
B-27 Supplement	Life Technologies	17504044	1 x
Penicillin/Streptomycin	Life Technologies	15140122	1 x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1 x
24-well שחור Visiplate עם מכסה	Perkin Elmer	1450-605	Tissue culture grade
אימונוציטוכימיה וכימות
PFA	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
Triton X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
Normal Goat Serum	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
עכבר חד-שבטי anti-MBP	Biolegend	SMI-99P	1:1000 דילול
rabbit polyclonal anti-Actin	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 דילול
ארנב פוליקלונלי אנטי-Olig2	Millipore	AB9610	1:1000 דילול
עז נגד עכבר 680RD	Licor	926-68070	1:500 דילול
goat anti-rabbit 800CW	Licor	926-32211	1:500 דילול
Alexa Fluor 594 goat anti-mouse	Life Technologies	A11032	1:000 דילול
Alexa Fluor 488 עז אנטי-ארנב	Life Technologies	A11008	1:000 דילול
Prolong Gold antifade with DAPI	Life Technologies	P36931
DPBS עם Ca2+ ו-Mg2+	Corning	21-030-CV
licor Odyssey Clx Infared Imaging System	Licor

td style='overflow:hidden;padding:0px 3px;vertical-align:bottom;'>Sigma-Aldrich