מדידת ביטוי חלבונים במוח מכרסמים באמצעות פלואורסצנציה קרובה לאינפרא אדום וסריקה ברזולוציה גבוהה

תקציר

מקור: Kimmelmann-Shultz, B., et. al. שימוש בקרינה קרובה לאינפרא-אדום וסריקה ברזולוציה גבוהה למדידת ביטוי חלבון במוח המכרסמים. J. Vis. Exp. (2019)

סרטון זה מדגים פלואורסצנציה קרובה לאינפרא-אדום ושיטת סריקה ברזולוציה גבוהה למדידת ביטוי חלבון במוח המכרסם.

פרוטוקול

כל ההליכים הנוגעים לדגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הוועדה המתאימה לבחינת אתיקה של בעלי חיים.

1. הדמיה

1. הנח שקופיות על ממשק הסריקה האינפרא אדום הקרוב כשהרקמה פונה כלפי מטה. תמונה של שקופית זכוכית אחת או מספר שקופיות בו-זמנית באמצעות כלי בחירה.

2. שקופיות תמונה המשתמשות בהגדרת האיכות הגבוהה ביותר עם היסט של 0 ננומטר ורזולוציה של 21 מיקרומטר. הסריקה תימשך בדרך כלל 13-19 שעות, תלוי בציוד הסריקה שבו נעשה שימוש.

3. ייבא תמונות לתוכנת ניתוח התמונות (למשל, Image Studio) כדי להציג ולסמן עבור חלבון כמותי למחצה ניתוח.

2. ניתוח ביטוי חלבון

1. פתח את תוכנת ניתוח התמונות ובחר את Work Area <span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>שלתוכו התמונה נסרק.

2. פתח את התמונה הסרוקה בתוכנת ניתוח התמונות כדי להציג את הסריקה, והתאם גם את אורכי הגל המוצגים כפי שהניגודיות, הבהירות וההגדלה המוצגים מבלי לשנות את תמונת ה-RAW או את הפליטה הכמותית הכוללת.

3. זהה את אזורי המפתח לכימות ובחר את ניתוח טאב לאורך החלק העליון של העמוד, ולאחר מכן בחר ציור מלבן (או צייר אליפסה/ Draw Freehand) כדי לצייר מלבן מעל האזור שיכומת.

4. כדי להציג את גודל המלבן, בחר Shapes לאורך הפינה השמאלית התחתונה של המסך, לאחר מכן בחר Columns בפינה הימנית התחתונה. הוסף גובה ו-רוחב עמודות לזיהוי גודל הצורה.

הערה: חשוב לשלוט בגודל הצורה בעת השוואת כמות. מומלץ להשתמש בצורות זהות הממוקמות במיקום הכימות הרצוי, על מנת לקבל דגימה מדויקת של הפליטות לאותו אזור.

5. לאחר מכן תן שם לצורה וחזור על הפעולה. לאחר דגימת כל האזורים, הנתונים הזמינים מcolumns tab יכול להיות מצטבר ומנותח.

חומרים