הדמיה של מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים

תקציר

מקור: Hamid, H. S., {{}}. הדמיה תלת מימדית וניתוח של מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים אנושיים. }J. Vis. exp. (2017)
}

} סרטון זה מדגים את השיטה להמחשת מיטוכונדריה ספציפית לעצב באמצעות הדמיה תלת מימדית. הוא מתאר את התהליך של רכישת סריקות עוקבות של סיבי עצב תוך-אפידרמיסיים מסומנים מראש ויצירת תמונות פני שטח תלת מימדיות כדי לבודד ולהציג מיטוכונדריה ביחס למבני עצבים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכרוכים באיסוף דגימות בוצעו בהתאם להנחיות ה-IRB של המכון.

1. הדמיה קונפוקלית

1. }{{}} לבצע הדמיה קונפוקלית:
   1. } לאסוף תמונות באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר עם מטרה של טבילת שמן פי 40 (צמצם מספרי 1.25 (NA)) על מיקרוסקופ הפוך.
      1. בכל מישור מוקד, רכשו ברצף אותות פלואורסצנטיים:
         גרעינים: עירור λ = 405 ננומטר, מסנן פליטה ספקטרלי λ = 420 - 480 ננומטר
         סיבי עצב: עירור λ= 488 ננומטר, מסנן פליטה ספקטרלי λ = 505 - 560 ננומטר
         מיטוכונדריה: עירור λ = 543 ננומטר, מסנן פליטה ספקטרלי λ= 606 - 670 ננומטר
   2. הזן את פרמטרי הסריקה הבאים לתוכנת המיקרוסקופ: קצב סריקה של 600 הרץ עם ממוצע של 2 פריימים וזום של 2.2; רזולוציית עוצמה של 12 סיביות (4096 רמות אפור).
      1. הגדר את תוכנת המיקרוסקופ לרזולוציה רוחבית אופטימלית (רזולוציית סריקה = 1,024 x 1,024) ורזולוציה צירית/חתך אופטי (צמצם קונפוקלי = יחידה אוורירית אחת (AU) עם גודל צעד z של 210 ננומטר).
         הערה: רזולוציית XYZ המתקבלת היא 172.2 ננומטר x 172.2 ננומטר x 210 ננומטר עם גודל תמונה של 176.1 מיקרומטר x 176.1 מיקרומטר x 30-50 מיקרומטר.
   3. הפעל סריקה חיה של אות העצב (פלואורסצנטי ירוק) והתאם את בקרת Z-Focus כדי למצוא ולהגדיר את מישורי המוקד העליונים והתחתונים בתוכנת המיקרוסקופ המקיפים את האות העצבי בתוך קטע הרקמה. טווח ה-z הכולל הוא בדרך כלל 30-50 מיקרומטר עבור קטע רקמה של 50 מיקרומטר.
   4. סובב את שדה הסריקה עם תוכנת המיקרוסקופ במהלך סריקה חיה כך שהאפידרמיס ממוקם אופקית או אנכית בתמונה.
   5. סרוק כל אות בנפרד והתאם את הגלאי (צינור מכפיל פוטו, PMT) מתח והיסט כדי למזער/להסיר פיקסלים רוויים מעל ומתחת.
      הערה: זמני הסריקה עם הפרמטרים הנ"ל נמשכים כ-20 - 40 דקות, תלוי במספר פרוסות ה-z.

2. 3D הדמיה וניתוח של מיטוכונדריה בתוך סיבי עצב תוך-אפידרמיס אנושיים

1. בודד את האפידרמיס התלת-ממדי:
   1. } שכפל את התמונה המקורית והשתמש בהקרנה בעוצמה המקסימלית (תצוגת מיקוד מורחבת) של התמונה כדי לזהות ולבודד את האפידרמיס.
   2. השתמש בכלי אזור עניין כדי לעקוב אחר הקצוות העליונים והתחתונים של האפידרמיס כדי להסיר אזורים לא רצויים, כגון שכבת הקרנית והדרמיס, שנעדרים מסיבי עצב תוך-אפידרמיס. חתוך לבחירה זו.
2. השתמש בדקונבולוציה על האותות הפלואורסצנטיים של העצב והמיטוכונדריה:
   הערה: דה-קונבולוציה עוזרת להחזיר את שלמות האותות הפלואורסצנטיים. השחזור המשמש בפרוטוקול זה נקרא דה-קונבולוציה עיוורת מכיוון שהוא משתמש באותות הפלואורסצנטיים בתמונות כדי לקבוע כמה האותות התפשטו ממקורם המקורי (פונקציית התפשטות נקודתית). התהליך משפר את רזולוציית האות על ידי הקצאה מחדש של התפשטות האות בחזרה למיקום המקור שלו.
   1. חשב פונקציית התפשטות נקודתית (PSF) עבור אות העצב הפלואורסצנטי הירוק (פלואורסצנטי ירוק) עם הפרמטרים הבאים:
      1. הגדר PSF מחושב לקונפוקלי. הגדר את מקדם השבירה הבינוני ל-1.515 ואת הצמצם המספרי ל-1.25. הגדר את חור הגלאי ל-1 AU. הגדר את אורך גל עירור הלייזר ל-488 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל-515 ננומטר.
   2. חשב PSF עבור האות המיטוכונדריאלי הפלואורסצנטי האדום (פלואורסצנטי אדום) עם הפרמטרים הבאים:
      1. הגדר PSF מחושב לקונפוקלי. הגדר את מקדם השבירה הבינוני ל-1.515 ואת הצמצם המספרי ל-1.25. הגדר את חור הגלאי ל-1 AU. הגדר את אורך גל עירור הלייזר ל-543 ננומטר ואת אורך גל הפליטה ל-617 ננומטר.
   3. בצע אופטימיזציה של האותות הפלואורסצנטיים של העצב והמיטוכונדריה על ידי דה-קונבולוציה באמצעות ה-PSFs המתאימים המפורטים לעיל ותכונת שחזור איטרטיבית מוגדרת בביטחון של 100% ומגבלת איטרציה של 10 מחזורים.
3. יצירת משטחים ספציפיים לעצב:
   1. השתמש בכלי "יצירת משטח" כדי ליצור משטח מוצק של העצבים מהתיוג המשני הירוק-פלואורסצנטי של תוצר הגן החלבוני 9.5 (PGP9.5) שזוהה.
   2. בטל את הסימון של התכונה "חלקה" והשתמש בתכונת העוצמה המוחלטת כדי להגדיר את הסף לאות העצבי, מכיוון שהוא בהיר משמעותית מהפלואורסצנטיות ברקע.
   3. השתמש בתכונת העוצמה המוחלטת כדי להגדיר את הסף עבור אות העצב מכיוון שהוא בהיר משמעותית מהפלואורסצנטיות ברקע. הגדר ערך סף נמוך מספיק כדי לזהות במדויק את העצבים.
   4. סנן משטחים קטנים שאינם עצביים על סמך גודל.
      הערה: במידת הצורך, ערוך ידנית משטחים נוספים שאינם עצביים בלשונית "עריכה" על ידי לחיצה ממושכת על מקש CONTROL כדי לסמן אובייקטים מרובים ולאחר מכן מחיקתם באמצעות מקש Delete.
4. בידוד אות מיטוכונדריאלי פלואורסצנטי ספציפי לעצב:
   1. בחר בלשונית עריכה של משטח העצב כדי להציג את התכונה "מאפייני מסכה". משטח העצב שנוצר משמש לבידוד מיטוכונדריה בתוך אותם עצבים הרחק מאותות מיטוכונדריאלים הקשורים לקרטינוציטים.
   2. כאשר כפתור "מסכה הכל" פותח חלון "ערוץ מסכה", בחר את האות האדום-פלואורסצנטי המפורק מהתפריט הנפתח למטה תחת "בחירת ערוץ" עבור האות המיטוכונדריאלי.
   3. לחץ בתיבה כדי לשים סימן ביקורת באפשרות "שכפל ערוץ לפני החלת מסכה".
   4. לחץ על כפתור הבחירה מול האפשרות "קבוע בפנים/בחוץ" של הגדרות המסכה ולחץ בתיבה כדי לשים סימן ביקורת באפשרות "הגדר את המשטח החיצוני ל" והקלד 0.00 עבור הערך. לחץ על כפתור אישור כדי ליצור את הערוץ החדש המייצג אותות מיטוכונדריאלים בתוך פני השטח של העצב.
5. יצירת משטחים ספציפיים למיטוכונדריה:
   1. השתמש בכלי "יצירת משטח" כדי ליצור משטח מוצק של המיטוכונדריה מהתעלה הפלואורסצנטית החדשה שנוצרה של האותות המיטוכונדריאלים הספציפיים לעצב.
   2. בטל את הסימון של התכונה "חלקה" ובחר בתכונה "חיסור רקע" כדי להגדיר את הסף. תכונה זו משתמשת בניגודיות מקומית סביב האות המיטוכונדריאלי כדי לזהות מיטוכונדריה מהרקע.
   3. הגדר את ערך הסף נמוך מספיק כדי לזהות מיטוכונדריה במדויק. בדוגמה זו, הסף התחתון נקבע ל-2,000 עבור סולם של 16 סיביות (65,536).
   4. סנן משטחים מיטוכונדריאלים על פי גודל. בדוגמה זו, מגבלת הווקסל הוגדרה ל-1.0 ווקסלים, שהיא המגבלה הנמוכה ביותר האפשרית. במידת הצורך, ערוך ידנית משטחים שאינם מיטוכונדריה בכרטיסייה "ערוך" על ידי לחיצה ממושכת על מקש CONTROL כדי לבחור אובייקטים מרובים ולאחר מכן מחיקתם באמצעות מקש Delete.
      הערה: מדי פעם, התוכנה תיצור משטחים שאינם משויכים לאות מיטוכונדריאלי פלואורסצנטי מובחן. במקרים כאלה, אפשר להסיר אותם באמצעות הלשונית "עריכה".

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר Leica SP5	Leica Microsystems, Buffalo Grove, IL	SP5
תוכנת Volocity x64	פרקין אלמר, וולת'ם , MA	} גרסה 4.4.0	תוכנת Volocity משמשת לעיבוד תמונה
תוכנת ניתוח תלת מימד של Imaris x64{{TAG_ 31}}	Bitplane, Concord, MA	גרסה 7.7.1	תוכנת אימאריס משמשת לניתוח תמונות