הדמיית סידן ex vivo לחקר תגובות המוח של דרוזופילה לנוירופפטידים

תקציר

מקור: Ishimoto, H. et. al., הדמיית סידן ex vivo להמחשת תגובות המוח לאיתות אנדוקריני בדרוזופילה. J. Vis. exp. (2018)
}{{}}}

{{}}} סרטון זה מדגים הדמיית סידן למחקרDrosophila תגובות מוח לנוירופפטידים. נוירונים המבטאים אינדיקטור סידן פלואורסצנטי חושפים דינמיקת סידן תוך תאית ותגובות תפקודיות למולקולות איתות.

פרוטוקול

1. הכנת צמחי מוח זחלים

1. צור תא הדמיה.
   NOTE: הקלטה יציבה דורשת שחרישי המוח יהיו קשורים. כאן, נעשה שימוש בתא הדמיה בעבודת יד בעלות נמוכה ב-Ca²⁺ הדמיה.
   1. בעזרת מלקחיים, גרדו את המרכז התחתון של צלחת תרבית פלסטית (35 מ"מ x 10 מ"מ) כדי ליצור שקע לגנגליון הגחוני של מוח הזחל, מה שמקל על ההרכבה (שלב 1.3, איור 1).
   2. בעזרת קיסם, הניחו טיפה קטנה של דבק-על משני צידי השקע והצמידו מוט טונגסטן (קוטר 0.125 מ"מ, אורך 6 עד 7 מ"מ) לדבק.
   3. בעזרת חתיכה קטנה של דבק רב פעמי דמוי שפכטל, צור קיר עגול (בקוטר 10 מ"מ וגובה 3 מ"מ) המקיף את השקע (איור 1).
      NOTE: החלל שבתוך הקיר יתמלא מאוחר יותר במי מלח עם חוצץ פוספט (PBS; 0.14 M נתרן כלורי (NaCl), 0.0027 M אשלגן כלורי (KCl), 0.01 M יון פוספט (PO4^3–), pH 7.4 ±-0.05 ב-25°C).
2. הכנת בעלי חיים
   NOTE: עבור הדמיית סידן, אינדיקטור סידן, GCaMP6s, מתבטא בסוג התא המעניין, אשר מושג בדרך כלל באמצעות שילובים של GAL4 ספציפי לרקמה ו-UAS-GCaMP6s. כדי להבטיח שהאות מתווך דרך הקולטן המועמד, GCaMP6s מתבטא גם בפגם מוטנטי בקולטן.
   1. כאשר נדרשות השוואות ניסיוניות לגנוטיפים שונים כגון סוג בר ומוטאנטים, זחלי בדיקת התאמת גיל כדי למנוע שינויים ברמת הביטוי של GCaMP6 והבדלים פיזיולוגיים עקב שלבי התפתחות.
   2. החזיקו את זבובי ההורים (30 זבובים לכל מין) בבקבוקון תרבית המכיל מזון זבובים סטנדרטי למשך 8 שעות כדי לאפשר הטלת ביצים על פני המזון. זחלי תרבות במסה במחזור אור-חושך של 12 שעות ב-25 מעלות צלזיוס ו-60-70% לחות יחסית.

3. דיסקציה של מוח הזחל
   1. ב-90-120 שעות לאחר הטלת הביצים (AEL), אסוף זחלים ושטוף אותם לפחות 3 פעמים במים מזוקקים כדי להסיר שאריות מזון דביקות.
   2. הניחו זחל על זכוכית שעון מרובעת בגודל 1.5 אינץ' מלאה ב-PBS קר כקרח.
      NOTE: שני השלבים הבאים מתבצעים בזכוכית שעון זו תחת מיקרוסקופ הניתוח.
   3. השתמש במלקחיים כדי לתפוס בעדינות את החלק האמצעי של הזחל. השתמש במלקחיים אחרים כדי לתפוס את ווי הפה ומשוך את ווי הפה בעדינות כדי להפריד את החלק הקדמי של הזחל המכיל את המוח משאר הגוף.
      NOTE: לחלופין, ניתן להשתמש במספריים כירורגיים.
   4. החזיקו את הקצה הקדמי במלקחיים וסובבו את הזחל כלפי חוץ. הסר רקמות זרות המחוברות למוח, כגון דיסקים דמיוניים, גופי שומן ובלוטות טבעת. הפרד בעדינות את המוח מחלקי הפה.
   5. מרחו 200 מיקרוליטר של PBS על החלק הפנימי של הטבעת העשויה מהדבק הרב-פעמי דמוי המרק בתא ההדמיה. מצצו בעדינות את המוח המנותח עם PBS לתוך פיפטה של פסטר, ולאחר מכן העבירו אותו לתא ההדמיה.

4. הכנסת המוח לתוך תא ההדמיה
   1. השתמש במלקחיים כדי לתפוס סיבי שריר המשתרעים מגרעיני הגחון. הכניסו את המוח בעדינות לתוך השקע שמתחת לחוט הטונגסטן.
   2. בעזרת מלקחיים אחרים, משוך מעט את חוט הטונגסטן כלפי מעלה כדי למקם את המוח במיקום הנכון להדמיה (איור 1).

2. רכישת Ca²⁺ תמונות פלואורסצנטיות

הערה: explants מוחיים שקועים ב-PBS מצולמים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בעדשה אובייקטיבית טבילה במים פי 20 (צמצם מספרי, NA = 0.5). PBS אינו מפעיל תאים במוח. אם יש צורך בתמונות ציר Z, עדשת האובייקט מותקנת עם מעביר עדשה המופעל על ידי פיזואלקטרי. ראש קונפוקלי דיסק מסתובב משמש לשיפור רזולוציית הזמן. להדמיה בתאורה חלשה, מצלמת מכשיר מצמד מטען מכפיל אלקטרונים מותקנת על המיקרוסקופ. הדמיה של פלואורסצנטיות GCaMP6s (עירור/פליטה: 488/509 ננומטר) דורשת לייזר של 488 ננומטר לעירור עם מפצל אלומה דיכרואי ומסנן פליטה (e.g., 528 ± מסנן פס פס 38 ננומטר).

1. מקם את תא ההדמיה המכיל את explant המוח מתחת למיקרוסקופ.
2. הורד את עדשת האובייקט עד שהיא נוגעת ב-PBS. תחת תאורת שדה בהיר, מקם את המוח והבא אותו למיקוד. עבור לאור פלורסנט והתאם את המיקוד על התאים המסומנים ב-GCaMP6s.
   NOTE: הירוק הבסיסי הקרינה של ה-GCaMP6s צריכה להיות גלויה.
3. התחל את הרכישה במהירות של 250 אלפיות השנייה למסגרת ברזולוציה של 512 × 512 פיקסלים במצב קירור מים באמצעות תוכנת הרכישה המתאימה (e.g., μManager). כוונן את זמן החשיפה כדי לקבל ערכי פלואורסצנטיות בטווח הדינמי של מצלמת ההתקן המצמד לטעינה (CCD), אך לא נמוך מ-1000 (יחידות שרירותיות), עם תמונות של 16 סיביות (טווח דינמי 0-65,535).
   NOTE: יש להשתמש בזמן חשיפה נמוך כדי למזער את הלבנת התמונות של ה-GCaMP6s. יש לייעל את זמן החשיפה בכל ניסוי מכיוון שהוא תלוי ברמות הביטוי של GCaMP6 וברגישות של מערכת הזיהוי. זה היה 100 אלפיות השנייה בניסוי שלנו באמצעות dilp2>GCaMP6s. כאשר נדרשים חתכי z לעומק הדמיה נתון, ניתן לרכוש מספר תמונות של חתך z בהתאם לזמן החשיפה ולמרווחי הפריימים. אם למצלמה יש מספיק רזולוציה מרחבית, יש להגדיל את גודל ה-binning (מספר האוגרים על השבב שיאוחסנו לפיקסל דיגיטלי אחד) כדי להפחית את זמן החשיפה.
4. לאחר קביעת פרמטרי ההדמיה, צלם תמונות למשך דקה אחת לפני מתן הפפטיד כדי לזהות עוצמות אות בסיסיות (F₀).
5. החל את פפטיד הבדיקה; לשם כך, ממיסים 100 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד ב-PBS ופיפטה אותה ישירות לאמבט הזחלים כדי להניב ריכוז אופטימלי.
   NOTE: הפפטיד יש להזריק את הפתרון לאט (e., קצב זרימה 20 מיקרוליטר לשנייה) לתוך תמיסת האמבטיה באמצעות פיפטה. פפטיד סינתטי לא קשור המומס ב-PBS משמש כבקרה שלילית.
6. הקלט את פליטת ה-GCaMP6s למשך מספר דקות.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
מוט טונגסטן	מערכות A-M, סקווים, וושינגטון, ארה"ב	717000
} Blu Tack	}בוסטיק, פריז, צרפת	3049100	}דבקים רב-פעמיים דמויי שפכטל
זכוכית שעון, square, 1 5/8 in	חברת האספקה הביולוגית של קרוליינה, ברלינגטון, קרוליינה הצפונית, ארה"ב	742300
PBS	TAKARA Bio Inc., Kusatsu, Shiga, Japan	}T900	}מלחים חומציים פוספטים
CCHa2	SCRUM Inc., טוקיו, יפן		פפטיד מסונתז של קוסטום
}Ghrerin	מכון פפטיד בע"מ, אוסקה, יפן	}4372-s
}Nociceptin	מכון פפטיד בע"מ, אוסקה, יפן	4313-v
}Axio Imager A2	Carl Zeiss, Oberkochen, Germany	}Axio Imager A2	}} מיקרוסקופ פלואורסצנטי
Objective W N-Achroplan 20x/0.5 M27	Carl Zeiss, אוברקוכן, גרמניה	420957-9900-000	עדשת אובייקטיבית לטבילה במים
סורק אובייקטיבי P-725 PIFOC עם טווח נסיעה ארוך	מכשיר פיזיקה e GmbH & Co. KG, קרלסרוהה, גרמניה	N/A	Piezoelectric-activated lens mover
יחידת סורק קונפוקלית CSU-W1	יוקוגאווה אלקטריק תאגיד, טוקיו, יפן	CSU-W1	} ראש קונפוקלי של דיסק מסתובב
ImagEM C9100-13	Hamamatsu Photonics, Sizuoka, Japan	C9100-13	EM-CCD camera
}OBIS 488 ננומטר LS 60 mW	}קוהרנטי, סנטה קלרה, קליפורניה, ארה"ב	1178770	488-ננומטר לייזר
488/568/647 ננומטר מפצל אלומה דיכרואי יוקוגאווה	}סמרוק, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב	Di01-T405/488/568/647-13x15x0.5	מפצל קרן דיכרואי
528/38 ננומטר מסנן פס פס יחיד של BrightLine	Semrock, רוצ'סטר, ניו יורק, ארה"ב	FF01-528/38-25	מסנן פליטה
μManager	Open Imaging, Inc.	N/A	https://micro-manager.org