הדמיה חיה של פעילות הריסים של תאים אפנדימליים בקטע מוח של עכבר

תקציר

מקור: Al Omran, A. J., et al. הדמיה חיה של הריסים האפנדימליים בחדרים הצדדיים של מוח העכבר. {{}}J. Vis. exp. (2015).

}סרטון זה מדגים טכניקת הדמיה חיה באמצעות מיקרוסקופ ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית (DIC) כדי לצפות בפעימות של ריסים אפנדימליים במקטעי מוח של עכבר סגיטלי. ריסים אפנדימליים מניעים נוזל מוחי שדרתי (CSF), ופעילותם נרשמת בחלקי מוח הנשמרים בתווך עשיר בחומרים מזינים ומצולמים בתא מבוקר אקלים. סרטונים בעלי ניגודיות גבוהה מאפשרים לזהות ריסים פונקציונליים ולכמת את תדירות הפעימות שלהם.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי ועדת הביקורת האתית המתאימה לבעלי חיים.

1. מיצוי מוח, חתך והכנת רקמות

1. להקריב זן עכבר מסוג פרא C57BL/6 על ידי המתת חסד עמוקה עם CO₂ חנק למשך 5 דקות. להבטיח מוות על ידי פריקת צוואר הרחם.
2. נקה את ראש העכבר עם 70% אתנול.
3. בצע כריתת קרניקטומיה באמצעות מספריים ומלקחיים סטריליים על ידי משיכת העור תחילה, החל מהחלק העליון של הראש כדי לחשוף את הגולגולת.
4. לאחר מכן, כאשר הגולגולת חשופה, הסר את הגולגולת על ידי קילוף העצם חתיכה אחר חתיכה, החל מהצד האחורי ונע לכיוון הצד הקדמי. היזהר לא להרוס את חדרי המוח.
5. אסוף את כל המוח.
6. מניחים את המוח בצלחת פטרי בקוטר 100 מ"מ המכילה את מדיום הנשר המותאם (DMEM)/גלוקוז גבוה של דולבקו בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS) ותמיסת פניצילין/סטרפטומיצין 1% המכילה 10,000 יחידות/מ"ל פניצילין ו-10,000 מיקרוגרם/מ"ל סטרפטומיצין ומחומם מראש ל-37 מעלות צלזיוס.
7. פורסים את המוח במישור הסגיטלי החציוני ביד עם להב חד, והשתמש ברטט כדי להשיג את הקטע הראשון של 100-200 מ"מ מכל מחצית.
8. שטפו את רקמת המוח בתמיסת מלח מחוממת מראש ב-37 מעלות צלזיוס עם חוצץ פוספט (1x PBS).
9. מקם מיד את אזור המוח ב-DMEM/מדיה עם גלוקוז גבוה שחוממה מראש ל-37 מעלות צלזיוס.

2. תצורה והגדרה של הדמיה חיה

1. {{}}הנח את חלקי רקמת המוח בכלי תרבית עם תחתית זכוכית בגודל 30 מ"מ המכילים 1 מ"ל של חומר DMEM/גלוקוז גבוה. התאם את סביבת התא הסגור של המיקרוסקופ ל-37 מעלות צלזיוס, 95%/5% O₂/CO₂} (} איור 1).
2. באמצעות עדשת טבילת שמן אובייקטיבית 60X, אסוף את תמונות תאי האפנדימל/ריסים על ידי הנחת טיפת שמן על עדשת האובייקט 60X והתמקדות בתאים עם ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית רגילה (DIC) המועברת.
3. לאחר מכן, עקוב אחר הכיוון של תנועת בועות ה-DMEM כמדריך למיקום הריסים האפנדימליים התנועתיים, שכן מכות ריסניות יוצרות מעין תנועת בועות באזור. בחר אזור המכיל תאים בריאים עם ריסים תנועתיים בחדר הצדדי של המוח באמצעות מסנן DIC. לאחר מציאת הריסים האפנדימליים, התאם את האור והמיקוד כדי לקבל תמונה משביעת רצון.
4. באמצעות תוכנת הדמיה Metamorph, הגדר את פרמטרי ההדמיה החיה בהתאם למטרה מסוימת. בהדגמה הנוכחית, רכוש תמונות של עשרים וארבעה סיביות כאשר שילוב המצלמה מוגדר ל-1 x 1 בשילוב עם אובייקט של 60X וזמן חשיפה של 5-10 msec.
5. אסוף את תמונות ה-DIC על ידי פתיחת צמצם המיקרוסקופ לרמה אופטימלית לזמן חשיפה מינימלי. צפה בתמונות חיות המוזרמות למצלמה כדי לספק רכישת תמונה מהירה ומיידית ללא דיחוי. חשב את מהירות פעימות הריסים על סמך הדרישה של זמני החשיפה המינימליים כדי להשיג ניגודיות תמונה מספקת.

תוצאות

חומרים