הדמיה של מיטוכונדריה עצבית באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק-פנים סדרתי

תקציר

מקור: Mukherjee, K., et. al. ניתוח המיטוכונדריה במוח באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סריקת פנים סדרתית. J. Vis. exp. (2016)

{סרטון זה מדגים את ההכנה, הדמיה וניתוח של רקמת מוח של עכבר באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים סורק בלוק-פנים סדרתי (SBFSEM) כדי להמחיש אולטרה-מבנה מיטוכונדריאלי, המאפשר מיפוי מדויק של המורפולוגיה וההתפלגות המרחבית שלהם בתאים עצביים אקסונליים ודנדריטיים.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי המתאים ועדת ביקורת אתית של בעלי חיים.

1. הכנת רקמת מוח והדמיית SBFSEM

1. להרדים עכבר שחור C57 צעיר (~2 - 4 חודשים) (זן C57BL/6J) באמצעות 4 - 5% איזופלורן בהתאם להנחיות המוסדיות. אשר את ההרדמה על ידי ניטור אובדן טונוס השרירים, היעדר תנועות רצוניות ותגובות לגירויים מרתיעים כמו צביטת זנב.
2. הצמד את העכבר למגש דיסקציה ובצע חתך בעור לאורך קו האמצע הגחוני. בצע חתכים נוספים בעור כדי לחשוף את כלוב הצלעות של העכבר. חתכו את הסרעפת, חתכו בזהירות את חלל החזה לאורך ההיקף כדי לחשוף את הלב הפועם, ואז בצעו חתך באטריום הימני.
3. בעזרת צינורית פרפר, קנול את החדר השמאלי. לחלחל את העכבר באופן טרנס-קרדי באמצעות 10 - 20 מ"ל של מי מלח חוצץ פוספט (PBS) pH 7.2, עד לאישור הוצאה על ידי שינוי בצבע הכבד.
   note: שינוי בצבע הכבד משמש כמדריך לקביעת מידת האקסנגינציה. ודא שצבע הכבד משתנה מחום אדמדם לוורוד בהיר.
4. החדרו את העכבר דרך הלב באמצעות 10 - 20 מ"ל של 2% גלוטראלדהיד ו-4% פרפורמלדהיד המיוצרים במאגר קקודילאט של 0.10 M (pH 7.2), כדי לקבע את רקמת המוח במהירות מבפנים. הקיבוע מנוטר על ידי התבוננות בהתקשות הזנב.
   note: הכן מאגר קקודילאט 0.10 M (pH 7.2) על ידי המסת 2.14 גרם נתרן קקודילאט ב-80 מ"ל מים, הוסף חומצה הידרוכלורית כדי להתאים את ה-pH, והפוך את הנפח ל-100 מ"ל עם מים.
5. לאחר הזילוף, ערפו את ראשו של העכבר ונתחו את המוח, ולאחר מכן קיבעו את הקיבוע במאגר נתרן קקודילאט של 0.10 M (pH 7.2) המכיל 2% גלוטראלדהיד ו-4% פרפורמלדהיד למשך 48 שעות ב-4 ^oC.
6. לאחר 48 שעות בצע חתכים קורונליים של 400 מיקרומטר באמצעות ויברטום ולאחר מכן נתח בזהירות את אזור העניין במוח (לדוגמה, ההיפוקמפוס) תחת מיקרוסקופ הדיסקציה. חתוך בזהירות את הרקמה וצלם תמונה לשמירה על כיוון.
   note: שיטות לאחר עיבוד של צביעת רקמות ב-SBFSEM משלבות מגוון שיטות צביעת מתכות כבדות על מנת לשפר את הרזולוציה. .
7. שטפו את הרקמות הקבועות בגלוטרלדהיד 3 פעמים, 5 דקות כל אחת, במאגר קקודילאט של 0.1 M (pH 7.2).
8. הכן תמיסת חומצה טאנית 0.1% על ידי המסת חומצה טאנית במאגר נתרן קקודילאט 0.1 M (pH 7.2). מערבבים עד להמסה ומסננים דרך פילטר של 0.45 מיקרומטר, במידת הצורך.
9. Postfix את הרקמות עם חומצה טאנית 0.1% של קקודילאט על ידי דגירה במגיב של 1 מ"ל למשך 30 - 60 דקות ב-RT.
   note: זמן הדגירה תלוי בגודל הרקמה, אך 30 דקות עובדות בצורה הטובה ביותר עבור רוב הרקמות.
10. שטפו רקמות 3 פעמים, 5 דקות כל אחת, במאגר קקודילאט (pH 7.2).
11. ממיסים 0.3 גרם אשלגן פרוציאניד ו-0.86 גרם נתרן קקודילאט ב-10 מ"ל מזוקק H₂O (dH₂O). שמור את תמיסת האשלגן פרוציאניד על קרח. רגע לפני השימוש, הוסף 10 מ"ל של 4% אוסמיום טטרוקסיד (OsO₄).
12. מכתים את הרקמות בתמיסת אוסמיום-פרוציאניד 2% למשך 90 דקות, על קרח. שטפו 3 פעמים, 5 דקות כל אחת ב-dH₂O.
13. הכן תמיסת תיוקרבוהידרזיד (TCH) של 1% על ידי המסת 0.1 גרם TCH ב-10 מ"ל dH₂O. יש להמיס בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס על ידי ערבוב כל 10 דקות עד להמסה מלאה. הקפידו על אמצעי זהירות בעת הטיפול ב-TCH, במיוחד הקפידו להימנע משימוש במתכות, חימום לטמפרטורות גבוהות או לאפשר לתמיסה להתייבש.
14. טפל בדגימות עם 1% TCH טרי שהוכנו למשך 20 דקות ב-RT. שטפו 3 פעמים, 5 דקות כל אחת, ב-dH₂O.
15. דילול 4% OsO₄ עד 2% עם dH₂O, ורקמות כתמים עם טטרוקסיד אוסמיום מימי של 2% על ידי דגירה למשך שעה אחת. שטיפה רקמות 3 פעמים, 5 דקות כל אחת, עם dH₂O.
16. דגור את הדגימות O/N באורניל אצטט של 1% ב-dH₂O ב-4 °C.
17. הכן את תמיסת העופרת של וולטון.
    1. להמיס 0.998 גרם L-Aspartate ב-250 מ"ל dH₂O ולאחר מכן להוסיף 10 N אשלגן הידרוקסיד (KOH) בצורה טיפתית עד שה-pH מגיע ל-5.5. לאחר התאמת ה-pH, מוסיפים 0.066 גרם עופרת חנקתית ב-10 מ"ל ציר חומצה אספרטית ומחממים ל-60 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות.
18. שטוף רקמות ב-dH₂O ודגירה עם כתם אספרטט עופרת של וולטון למשך 30 דקות בתנור של 60 מעלות צלזיוס. שטפו 3 פעמים, 5 דקות כל אחת, ב-dH₂O.
19. ייבשו דגימות באמצעות סדרה מדורגת של אלכוהול באמצעות תמיסות צוננות של 20%, 50%, 75%, 85%, % ו-95% אתנול למשך 5 דקות כל אחת, ולאחר מכן 100% אתנול 3 פעמים, 10 דקות כל אחת.
    note: השתמש ב-100% אתנול מבקבוקים שנפתחו זה עתה, שכן אתנול פתוח סופג מים מהאוויר וגורם לכשל בהטמעה. יהיה צורך בדגירה ארוכה יותר עם דגימות רקמה גדולות יותר.
20. שטפו דגימות פעמיים, 15 דקות כל אחת, בתחמוצת פרופילן.
21. הכינו שרף הטמעה מפלסטיק באמצעות שרף של 25 מ"ל, 10.5 מ"ל DDSA (אנהידריד דודצניל סוקסיני), 15.5 מ"ל NMA (נאדיק מתיל אנהידריד) ו-1 מ"ל DMP-30 (2,4,6-טריס דימתיל-אמינומתיל פנול). מערבבים את השרף על ידי ניעור. סובב ואפשר לשרף לעמוד עד שהבועות נפתרות.
    note: זהו המתכון הסטנדרטי לקשיות בינונית. ניתן להשתמש בסוגים אחרים של שרף פלסטיק במיקרוסקופ אלקטרונים (EM) אך יש לבדוק אותם עם דגימת בקרה לא חיונית מראש מכיוון שלא כל השרפים עובדים עבור SBFSEM.
22. דגרו את הרקמות O/N בתערובת של 50:50 של שרף מוטמע ותחמוצת פרופילן בבקבוקון שמכוסה בתחילה וללא כיסוי לאחר שעתיים כך שתחמוצת הפרופילן מתאדה לאורך תקופה של כ-8 - 10 שעות.
23. העבירו את הרקמות לשרף הטמעה טרי ב-100% בבקבוקונים נקיים למשך שעתיים.
24. הטמיעו דוגמאות בשרף הטמעה טרי, בתבניות שטוחות המכילות תוויות נייר מודפסות, וריפאו אותן בתנור בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות. לאחר כשעה, בדוק שוב את מיקום הרקמה ויישור הרקמה והתאם במידת הצורך.
25. חתוך דגימות לאזור העניין והרכיב אותן על סיכת אלומיניום באמצעות דבק-על ציאנואקרילט ג'ל או שרף אפוקסי מוליך. לאחר מכן, מצפים את דפנות הבלוק במשחת כסף קולואידית כדי לספק נתיב מוליך לסיכת האלומיניום.
26. בחן דגימות רקמה באמצעות מערכת מיקרוסקופ אלקטרונים סורק המצוידת בשלב אולטרה-מיקרוטום בתוך החדר וגלאי אלקטרונים מפוזר לאחור בקילו-וולט נמוך.
    note: קבל הכשרה במכשירים ובאתר בשימוש במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM) והפוך למשתמש מורשה. לחלופין, שיתוף פעולה עם חוקר או מתקן ליבה לפרויקטים קטנים עשוי להיות אפשרי. ייתכן שיידרש גם אימון בקרינה מכיוון ש-SEMs מייצרים קרני רנטגן.
27. כדי לצלם את הדגימות, השתמש בהגדרות הבאות: 2.25 קילו וולט, ברזולוציה של 5 - 10 ננומטר לפיקסל, עם גדלי שדה בין 80 - 250 מיקרומטר ב- x,y (גדלי שדה אחרים אפשריים), ועובי פרוסה של 50 - 100 ננומטר, עם סה"כ 250 - 600 פרוסות בפרק זמן של 16 - 20 שעות.
    note: ההגדרות משתנות באופן מהותי בין מיקרוסקופים שונים, דגימות בודדות ורזולוציה רצויה. הגדרות אלה אמורות לייצר תמונות הניתנות לפירוש בקלות עבור דוגמאות רבות.

2. ניתוח מערך נתוני ההדמיה

הערה: תוכנת Image J/Fiji משמשת לניתוח מערך הנתונים ומסתמכת על התוסף TrakEM2. שלבי עיבוד מקדים עשויים להתבצע באמצעות מגוון תוכנות ועשויים להיות נרחבים או מינוריים בהתאם לרמת הניסיון והמחסניות שהושגו. הטרנספורמציות העיקריות באמצעות תוכנת הקוד הפתוח (ImageJ ver 1.50b, הורדת FIJI ב-1 באוקטובר 2015) מתוארות כאן.

1. המרת תמונות לתבנית tiff של 8 סיביות מהתמונות המקוריות של 16 סיביות על ידי פתיחת התוכנה ובחירת פריטי תפריט Image→Type→8 bit.
   1. אם המרת ניגודיות/בהירות אוטומטית בשלב זה אינה אידיאלית לתמונות, פתחו מחדש את התמונות של 16 סיביות ולחצו על Image→Adjust→Brightness/Contrast. בחר טווח שמתאים לכל התמונות ולחץ על Apply. לאחר מכן בצע המרה. note:<span style='font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'> ב-SEM מסוימים, שלב זה עשוי לדרוש מיקרוסקופ תוכנת יצרן.
   2. במידת הצורך, עקב תנועת תמונה לא מקובלת בין פרוסות (e.g. סחף עקב טעינה), רשום/יישר את אוספי התמונות (פריטי תפריט Plugins→Registration→Linear StackAlignmentWithSIFT). ברוב תוכנות הרישום, מוגדר למצב "תרגום בלבד" ולא ל"גוף קשיח".
      note: גישות ותוכנות רבות עשויות לעבוד: תוסף הרישום SIFT עובד עבור יישומים רבים ויש גרסת מחסנית וירטואלית.
      1. במידת הצורך, הגדל את בד הציור לפני הרישום (Image→Adjust→CanvasSize) או הקטן אותו לאזור עניין (Image→Crop).
         note: עלולה להתרחש סחיפה או התפרצות, וניסיון תוספים או תוכנות אחרות עשוי להניב תוצאות טובות יותר. אפשרויות ידניות זמינות גם (e.g. ImageJ/FIJI, תוספים→רישום→ManualLandmarkSelection).
   3. אם תרצה, שנה את קנה המידה של התמונות לגודל קטן יותר וקל יותר לניהול (e.g. 25%) באמצעות ImageJ (Image→Scale).

חומרים