זיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית עכבר באמצעות מעקב פלואורסצנטי

תקציר

מקור: Laboissonniere, et. al. רצף RNA של תא בודד של תת-קבוצות מוגדרות של תאי גנגליון ברשתית. J. Vis. exp.{{}} (2017).

}סרטון זה מדגים טכניקת מעקב פלואורסצנטית לזיהוי תת-סוגים של תאי גנגליון ברשתית (RGC) ברשתית של עכבר טרנסגני. התהליך כולל אבטחת הרשתית המבודדת בתא הקלטה, שמירה על כדאיות התא עם זלוף מחומצן, והתמקדות ב-RGCs עם תווית פלואורסצנטית באמצעות פיפטה עם עוקב. על ידי ניתוח מורפולוגיה וריבוד דנדריטי, השיטה מאפשרת סיווג של תת-סוגים מובהקים של RGC.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים דגימות של בעלי חיים נבדקו ואושרו על ידי הסקירה האתית המתאימה של בעלי חיים.

1. הכנת רקמת רשתית (2 שעות)

הערה: יש לבצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תאורה אדומה עמומה

1. הסתגלות כהה של בעלי חיים לפחות שעה אחת לפני הניתוח. בצע את כל ההליכים בתאורה אדומה עמומה.
2. המתת חסד של בעלי החיים על ידי CO₂ חנק וגרעין את גלגלי העיניים לצלחת פטרי עם תמיסה חוץ-תאית מחומצנת בעבר.
3. תקעו את הקרנית במחט וחתכו אותה על ידי חיתוך במספריים עיניים בגבול הקרנית והסקלרה.
4. הסר את העדשה באמצעות מלקחיים #5. עשה בעדינות קרע בסקלרה עם המלקחיים וחתוך את עצב הראייה במקום שבו הרשתית והסקלרה נפגשות. סיים בזהירות את הסרת הסקלרה מהרשתית.
5. הסר את הזגוגית השקופה באמצעות מלקחיים #5; לאחר הסרתו, הזגוגית מופיעה כחומר ג'לטיני שנדבק למלקחיים. פורסים את הרשתית לשניים (כך שיהיו 4 חתיכות/בעל חיים) ומאחסנים אותם בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת ב-RT עד לשימוש.
6. כאשר מוכנים להרכיב את הרקמה בתא ההקלטה, הניחו חתיכת רשתית לדגירה בתמיסת אנזים מדוללת ב-500 מיקרוליטר של תמיסה חוץ-תאית מחומצנת. דוגרים בצלחת פטרי למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT) על שייקר.
   1. שטפו את פיסת הרשתית בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת והניחו את הרקמה בתא הקלטה עם תחתית זכוכית; השתמשו בפיפטת העברה מפלסטיק כשהקצה חתוך כדי לאפשר העברת הרשתית מבלי לגרום נזק לרקמה.
7. השתמש במלקחיים כדי לשטח בזהירות את הרקמה כששכבת קולטני האור פונה כלפי מטה. הסר עודפי נוזלים באמצעות פיפטה. עוגן את הרקמה באמצעות טבעת פלטינה עם רשת ניילון.
   NOTE: שיטה זו יכולה לשמש גם להכנת הרקמה לבידוד RNA מתאי אמקרין ודו קוטביים מסומנים.
8. מלאו את החדר בתמיסה חוץ-תאית מחומצנת והרכיבו אותו על במת מיקרוסקופ. רקמת החדרה עם תמיסה חוץ-תאית מחומצנת במהירות של 2-4 מ"ל לדקה.

3. ויזואליזציה ומיקוד של תאי גנגליון רשתית GFP+ (10 דקות)

NOTE: יש לבצע את כל ההליכים בסעיף זה תחת תאורה אדומה עמומה

1. לפני שמתחילים, משוך מיקרופיפטות זכוכית (קוטר חיצוני [OD]: 1.2 מ"מ, קוטר פנימי [ID]: 0.69 מ"מ) להקלטות אלקטרופיזיולוגיות באמצעות מושך מיקרופיפטה. השתמש בפרוטוקול הבא עבור האלקטרודות (שימו לב שיש להתאים את הפרמטרים בהתאם כדי להשיג את ההתנגדות הרצויה וישתנו בין מושכים ועם זכוכית שונה): חום: רמפה +10; משיכה: 0; Vel: 23; עיכוב: 1; לחץ: 500; לולאת תוכנית: 5 פעמים. ודא שהטיפים בקוטר ~1 מיקרומטר, עם התנגדות של 2-4 MΩ למיקוד לתאים גדולים ושל 5-7 MΩ למיקוד לתאים קטנים יותר.
2. התבונן בשכבת תאי הגנגליון באמצעות אופטיקה של ניגודיות הפרעות דיפרנציאליות אינפרא אדום (IR-DIC) (איור 1A). זיהוי חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) + תאי גנגליון רשתית (RGCs) באמצעות אפיפלואורסצנציה (~480 ננומטר) (איור 1B).
3. אתר את הפיפטה המלאה בתמיסה תוך-תאית ב-DIC. הפעל לחץ חיובי קל וקיזוז מתח אפס על המגבר.
4. לחץ את המיקרופיפטה מזכוכית כנגד תא GFP+ והפעל לחץ שלילי ליצירת אטם GΩ בין הפיפטה לקרום התא. החל שלבי פקודת מתח בדיקה (למשל, 5 mV) כדי לפקח על התנגדות האיטום. לאחר יצירת אטימה יציבה, קרע את הממברנה על ידי הפעלת פולסים קצרים של לחץ שלילי כדי להשיג גישה לתא שלם.
5. המתן 1-2 דקות עד שהדנדריטים של התא יתמלאו בעוקב פלואורסצנטי.
   NOTE: ניתן להקליד את התא באופן מורפולוגי על ידי בחינת המורפולוגיה באפיפלואורסצנציה (איור 1C). במקרה של RGCs המבטאים מלנופסין, הריבוד הדנדריטי בשכבת הפרספקס הפנימית מודגם על ידי בחינת הדנדריטים המלאים בעוקב פלואורסצנטי תחת תאורה אפיפלואורסצנטית וקביעה אם הם מרובדים הרחק מהסומה בתת-למינה OFF (M1 ipRGCs), ליד שכבת תאי הגנגליון בתת-למינה ON (M2 ו-M4 ipRGCs), או שניהם (M3 ipRGCs). תצפית זו, בשילוב עם גודל הסומה (ל-M4 יש סומות גדולות באופן מובהק בהשוואה לכל תת-הסוגים האחרים של ipRGC), מאפשרת זיהוי של סוג התא. לפיכך, טכניקה זו מאפשרת זיהוי של סוג התא in vitro לפני בידוד RNA. ניתן לשנות שיטה זו עבור פרוטוקולי זיהוי אחרים של סוגי תאים הכוללים מורפולוגיה דנדריטית או פיזיולוגיה תאית.

תוצאות

איור 1: זיהוי סוגי RGCs על סמ...

חומרים