הדמיית פוטו-אקטיבציה פלואורסצנטית של הובלת נוירופילמנטים באקסונים של עכברים עם מיאלין

תקציר

מקור: Boyer, N. P. et. al., הדמיה וניתוח של הובלת נוירופילמנטים בעצב השוק של עכבר שנכרת. J. Vis. exp.} (2020)
}

{{}}

}סרטון זה מדגים את שיטת הפוטו-אקטיבציה הפלואורסצנטית לניתוח הובלת נוירופילמנטים באקסונים מיאליניים של עצבים היקפיים. על ידי מעקב אחר נוירופילמנטים ירוקים מתויגים בפלואורופור, הטכניקה מספקת תובנות לגבי הובלה אקסונלית במחלות ניווניות.

פרוטוקול

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת תמיסת מלח עצבית

1. הכינו 100 מ"ל של מי מלח של ברויאר: 98 מ"מ נתרן כלורי (NaCl), 1 מ"מ אשלגן כלורי (KCl), 2 מ"מ אשלגן די-מימן פוספט (KH₂}PO₄), 1 מ"מ מגנזיום גופרתי (MgSO₄), 1.5 מ"מ סידן כלורי (CaCl₂), 5.6% D-גלוקוז, 23.8 מ"מ נתרן בי-קרבונט (NaHCO₃) במים מזוקקים כפולים.
2. בועות 95% חמצן/5% פחמן דו חמצני (קרבוגן) דרך תמיסת המלח למשך 30 דקות לפחות לפני השימוש. ניתן לעשות שימוש חוזר בשאריות מי מלח תוך שבוע; עם זאת, יש לחמצן אותו לפני כל שימוש.
3. יוצקים מי מלח מחומצנים למזרק של 60 מ"ל ומוודאים שנותר אוויר מינימלי במזרק.

2. הרכבה ראשונית של תא הזלוף העצבי

1. חבר את המזרק ואת הצינור כפי שמוצג ב} איור 1A, הנחת צינור היציאה לתוך בקבוק פסולת.
2. הנח את האטם החיצוני לתוך בית תא הזילוף, וודא שעמודי הכניסה והיציאה של הזרימה מיושרים עם החורים באטם.
3. הנח את האטם הפנימי (סיליקון, עובי 100 מיקרומטר) על כיסוי עגול #1.5 (קוטר 40 מ"מ), החלק בזהירות את כל הקמטים באטם כדי להבטיח אטימה הדוקה. כדי להקל על הרכבה מאוחרת יותר, הנח את הכיסוי והאטם על מגבת נייר או נגב משימות כשהאטם פונה כלפי מעלה.

3. דיסקציה והכנה של עצב השוק של העכבר

1. להקריב את בעל החיים בשאיפת פחמן דו חמצני או בשיטה אחרת שאושרה על ידי מוסד. הפעל טיימר כאשר החיה מפסיקה לנשום, מכיוון שיש לבצע ניסויים רק תוך 3 שעות מרגע ההקרבה.
2. מרססים את הפרווה באתנול 70% ומסירים כמה שיותר מרגלי החיה והגב בעזרת סכין גילוח חשמלי.
3. בעזרת מספריים גדולים לדיסקציה, בצע חתך גבי בעור ליד אמצע עמוד השדרה והמשך את החיתוך סביב ההיבט הגחוני של החיה. החל מגזרה זו, החזר לאט את העור מהרגליים על ידי משיכתו בעדינות מהשריר וחיתוך הפאשיה.
4. הניחו את החיה במצב שכיבה על מגש חיתוך והצמידו את כל ארבע הכפות. אופציונלי להצמיד את הזנב כדי להפחית עוד יותר את התנועה.
5. בעזרת מספריים מיקרו-דיסקציה, בצע חתך בשרירי הירך באמצע הדרך בין הזנב לברך כדי לחשוף את העצב הסיאטי. ודא שהעצב, הנראה דרך השריר, אינו נחתך.
6. הארך את החתך בגב ובגחון כדי להסיר את השריר. באופן דומה, הסר את שרירי השוק, תוך שמירה על חתכים רדודים וקצרים כדי למנוע פגיעה בעצבים.
7. הסר שרירים עד שהעצב הטיביאלי נחשף במלואו מהנקודה שבה הוא מסתעף מהעצב הסיאטי (בברך) לעקב (איור 2A).
   הערה: בכל השלבים, כולל ואחרי דיסקציה של עצב השוקה, הימנע מחשיפה מיותרת לאור הסביבה כדי למזער הפעלה מקרית אפשרית של חלבון פלואורסצנטי ירוק הניתן להפעלה פוטו-אקטיבית (paGFP) בעצב.
8. אחוז בעצב הטיביאלי בקצה עמוד השדרה-פרוקסימלי בעזרת זוג מלקחיים וחתוך את העצב באמצעות מספריים מיקרו-דיסקציה. הקפידו לא להפעיל מתח על העצב, להרים אותו מהשריר, לחתוך כל חיבור.
9. חותכים את הקצה הדיסטלי של עצב השוקה ומעבירים לצלחת פטרי קטנה של מי מלח מחומצנים בטמפרטורת החדר. מנקודה זו ואילך בהליך, הקפד תמיד לעקוב אחר הקצוות הפרוקסימליים והדיסטליים של העצב.
   הערה: אחת הדרכים לעשות זאת היא לסמן את הקצה הדיסטלי של העצב בחיתוך זוויתי כך שהמחודד נראה לעין.
10. החל מהקצה הפרוקסימלי של העצב, אחוז בעדינות בקצוות האקסון החשופים עם זוג מלקחיים דקים מאוד.
11. בעזרת זוג מלקחיים שני, אחוז במעטפת העצב קרוב אליו, ומשוך לאט לכיוון הקצה הדיסטלי של העצב. מעטפת העצבים תחליק לאורך האקסונים עם התנגדות מינימלית. ודא שלא מופעל מתח מיותר על העצב במהלך תהליך זה.

4. מכלול תא זלוף עצבי סופי

1. אוחז בקצה הפרוקסימלי של העצב, מוציא אותו ממי המלח ומניח אותו באיטיות על הכיסוי של תא הזלוף בתוך הפתח המלבני של האטם הפנימי, תוך שמירה על מתח עדין על העצב בזמן שאתה מניח אותו כך שהוא מונח ישר.
2. הנח את מגלשת המיקרו-אמת המים מעל העצב כשהצד המחורץ, פונה לעצב וכיוון הזרימה מקביל לעצב. הפוך את מכלול הכיסוי והמיקרו-אקוודוקט והנח אותו בתוך בית תא הזלוף כששקופית המיקרו-אקוודוקט מחוברת לאטם החיצוני. העצב והאטם הפנימי שמסביב יהיו כעת דחוסים בין החלקת הכיסוי למגלשת המיקרו-אקוודוקטים, המופרדים על ידי האטם, כאשר החלקת הכיסוי פונה כלפי מעלה (}איור 1B).
3. אבטח את תא הזלוף על ידי הנחתו בבית המתכת וסיבוב טבעת הנעילה. ודא שבית הפלסטיק נמצא במלואו מתחת לכל תפסי המתכת והדק היטב כדי למנוע דליפת מי מלח. הידוק יתר עלול לסדוק את מגלשת המיקרו-אקוודוקט או החלקת הכיסוי. הפוך את החדר כך שהכיסוי פונה כלפי מטה.
4. לחץ לאט על בוכנת מזרק המלח כדי למלא את תא הזלוף. שמור את צינורות הכניסה והיציאה, בקבוק היציאה והמזרק מוגבהים מעל החדר עצמו בכל עת במהלך ההתקנה וההדמיה. זה מונע סיפון, שעלול להכניס בועות או לגרום לחוסר יציבות מיקוד עקב לחץ שלילי בתא.
5. העבירו את מכלול הזלוף לשלב מיקרוסקופ הפוך והרכיבו את מזרק המלח למשאבת המזרק. הפעל את המנוע במהירות מתאימה לקצב זרימה של 0.25 מ"ל/דקה. לאחר מכן חבר והפעל את מחמם התמיסה המובנה המוגדר ל-37 מעלות צלזיוס.
6. חבר את מחמם המטרה והגדר ל-37 מעלות צלזיוס, מרח שמן על המטרה והכנס את תא הזלוף לתוך תושבת הבמה.
7. מרחו שמן על כרית תנור החימום והצמידו לתא הזלוף. חבר והפעל את תנור החימום; מוגדר ל-37 מעלות צלזיוס.
   הערה: שינויים בטמפרטורה עלולים לגרום להיווצרות בועות בתא הזלוף עקב פליטת גזים של התמיסה. אם נוצרות בועות, הגדל בקצרה את קצב זרימת התמיסה פי 5-10 עד שהבועות מנקות את החדר.
8. נעל את תא הזלוף לתוך מתאם ה-stagה והביא את שמן המטרה למגע עם הכיסוי בצד התחתון של החדר.
   הערה: תא הביופטקס עם מתאם שלב ASI המשמש כאן מיועד לתצורת מיקרוסקופ הפוכה.

5. הפעלת פלואורסצנטיות ורכישת תמונה

1. {{}}באמצעות תאורת שדה בהיר, התמקדו בשכבת האקסונים על המשטח התחתון של העצב הקרוב ביותר למשטח הכיסוי (}איור 2B). ניתן לזהות אקסונים מיאליניים (בדרך כלל בקוטר של 1 - 6 מיקרומטר בעכברים בוגרים) על ידי נוכחות של מעטפת מיאלין, הנראית תחת תאורת אור משודרת בשדה בהיר ללא שיפור ניגודיות. שסעים וצמתים של שמידט-לאנטרמן נראים גם הם בקלות. אקסונים לא מיאליניים הם דקים יותר (בדרך כלל בקוטר <1 מיקרומטר) ונמצאים בדרך כלל בצרורות (צרורות Remak), שם הם בדרך כלל קרובים מדי מכדי להיפתר זה מזה.
2. אם זמין במיקרוסקופ, הפעל את מערכת המיקוד האוטומטי כדי לשמור על מיקוד במהלך הדמיית זמן-lapse.
3. רכוש תמונת ייחוס של שדה בהיר. רשום את כיוון העצב (קצוות עמוד השדרה הפרוקסימלי והדיסטלי) ביחס לתמונות.
4. רכוש תמונה קונפוקלית באמצעות לייזר 488 ננומטר ומסנן פליטה המתאים ל-paGFP (למשל, 525/50 ננומטר) כדי להקליט את האוטו-פלואורסצנציה שלפני האקונומיקה. שמור על עוצמת הלייזר נמוכה כדי למזער את ההלבנה, כאשר זמן החשיפה מותאם בהתאם כדי לזהות את האות החלש. כדוגמה, נתונים מייצגים נרכשו ב-5% עוצמת לייזר וחשיפה של 4 שניות. רשום את הגדרות הרכישה לשימוש בכל הניסויים העתידיים.
   הערה: לאחר פוטו-אקטיביזציה, הגדרות ההדמיה האידיאליות ייצרו יחס אות לרעש > 8 ופוטו-הלבנה של פחות מ-25% מהאות המקורי במהלך 20 תמונות. ניתן לדמות את האקסונים גם על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי רחב שדה כפי שעשינו במקור, אך איכות התמונה תהיה נחותה בגלל חוסר קונפוציות.
5. הגדר את עוצמת הלייזר לעוצמת הדמיה רגילה פי 5 בערך ורכוש תמונה עם זמן חשיפה של 3-4 דקות. למרות שאינו חיוני, שלב זה מומלץ להלבנת אוטו-פלואורסצנציה ומקורות אחרים של פלואורסצנציה לא רצויה על מנת להפחית את אות הרקע ובכך למקסם את האות לרעש של הקרינה הפוטו-אקטיבית.
6. רכוש תמונה עם ההגדרות המשמשות בשלב 5.4 כדי להקליט את האוטופלואורסצנטיות לפני ההפעלה לאחר שלב הלבנה זה.
7. בתמונת השדה הבהיר, צייר קו מקביל לאקסונים באורך השווה לגודל חלון ההפעלה הרצוי. אורכו של חלון זה ישתנה בהתאם למטרת הניסוי ולפרמטרים, אך האורכים האופייניים הם 5 מיקרומטר עבור פרדיגמת בריחת הדופק ו-40 מיקרומטר עבור פרדיגמת התפשטות הדופק.
8. השתמש בקו זה כמדריך, צייר אזור עניין מלבני (ROI) על פני שדה הראייה בניצב לאקסונים. האזור חייב להקיף את כל האקסונים כדי לעבור פוטו-אקטיביזציה.
9. קבע הגדרות אופטימליות לפוטו-אקטיבציה עם תאורה של 405 ננומטר.
   הערה: בצע את השלב הזה ואת תת-השלבים רק לפני ההפעלה הניסיונית הראשונה. במהלך הניסוי, יש להשתמש באותן הגדרות פוטו-אקטיביות.
   1. הפעל אזור עניין שוב ושוב באמצעות קו לייזר של 405 ננומטר, עוצמת לייזר נמוכה (למשל, 5%) וזמן שהיית פיקסלים (למשל, 40 מיקרון), ופולס אחד, ורכישת תמונה של החלבון הפלואורסצנטי הירוק המופעל או הקרינה GFP לאחר כל הפעלה. חזור על הפעולה עד שהפלואורסצנטיות כבר לא גדלה, ולאחר מכן כמת את הקרינה באזור מעניין עבור כל תמונה.
   2. שרטט את עוצמות הקרינה הממוצעות לעומת מספר הדופק. בחר את מספר הפולסים שלאחריהם הקרינה כבר לא עולה כמספר הפולסים האופטימלי להפעלה.
10. הפעל את הקרינה paGFP באזור שצויר בשלב 5.8 על ידי עירור מעוצב עם אור של 405 ננומטר. ודא שתמונה נרכשת ממש לפני ההפעלה ומיד.
    הערה: הפעלת ה-paGFP האידיאלית תייצר אזור מוגדר בבירור של פלואורסצנטיות עם גבולות חדים הכלולים באזור העניין או החזר ההשקעה.
11. הפעל טיימר של דקה אחת עם סיום ההפעלה. בתום דקה אחת, התחל לרכוש סידרה של קיטועי זמן.
    הערה: ההשהיה של דקה אחת נחוצה כדי לאפשר את העלייה בקרינה שנצפתה בעקבות הפוטו-אקטיבציה של paGFP. עבור שיטת התפשטות הדופק, תקופת רכישה של 5-10 דקות עם מרווחי זמן של 30 שניות מספיקה למדידת השיפועים הראשוניים בחלונות המרכזיים והצדדיים כדי למדוד מהירות וכיווניות. עבור שיטת בריחת הדופק, תקופת רכישה של 30-150 דקות עם מרווחי זמן של 5 או 10 דקות מאפשרת ניתוח של התנהגות ההשהיה ארוכת הטווח של החוטים.
12. שמור את כל התמונות שנרכשו, כמו גם את ההחזר על ההשקעה המשמש להפעלת הקרינה.
13. עבור לאזור חדש של העצב וחזור על שלבים 5.1-5.11. אם האזור החדש נמצא לאורך אותו אקסון, הוא חייב להיות לפחות 500 מיקרומטר מהאזור שהופעל קודם לכן כדי למנוע זיהוי של נוירופילמנטים פלואורסצנטיים שיצאו מהאזור המופעל האחר. רכישת ה-Timelapse הסופי חייבת להסתיים לפני תום חלון 3 השעות.
    הערה: יתכן שההכנה תימשך יותר מ-3 שעות, אך לא אישרנו זאת. עם ניתוח והכנה מיומנים, ניתן לרכוש בין חמש לשמונה ערכות תמונות של 10 דקות בתוך חלון זה של 3 שעות.
14. לאחר רכישת סדרת התמונות הסופית של זמן-lapse, עצור את זרימת מי המלח, נתק את התמיסה ותנורי החימום והסר את מנגנון הזלוף משלב המיקרוסקופ.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
14 x 22 אטם מלבן 0.1 מ"מ	Bioptechs	1907-1422-100	Inner gasket
2-deoxy-D-glucose	Sigma	D6134
30 מ"מ אטם עגול עם חורים	Bioptechs	1907-08-750	אטם חיצוני
35 x 10 מ"מ צלחת	Thermo Fisher	153066	Dissection dish
40 מ"מ כיסויים עגולים	Bioptechs	40-1313-0319
60mL siringe - קצה Luer-lock	BD	309653
Andor Revolution WD spinning-disk confocal system	Andor		מצויד במערכות מיקוד מושלם ו-FRAPPA
Calcium chloride	פישר	C79
Coverslips	פישר	12-541-B	עבור שקופית פלואורסצאין
D-(+)-glucose solution	Sigma	G8769
ניתוח סיכות	כלים מדעיים עדינים	26001-70
מלקחיים של חיתוך	כלים מדעיים עדינים	11251-30	מלקחיים עדינים
מיקרוסקופ חיתוך	Zeiss	47 50 03
מחבת חיתוך עם שעווה	גינסברג סיינטיפיק	568859
מספריים לניתוח	כלים מדעיים עדינים	14061-09	מספריים לניתוח ראשוני
FCS2 perfusion chamber	Bioptechs	60319-02-03
נתרן פלואורסצאין	Fluka	46960
Inline solution heater	וורנר אינסטרומנטס	SH27-B
מלקחיים למינקטומיה	כלים מדעיים עדינים	11223-20	מלקחיים של חיתוך ראשוני
מגנזיום גופרתי	Sigma-Aldrich	M7506
שקופית מיקרו-אקוודוקט	Bioptechs	130119-5
שקופיות מיקרוסקופ	פישר	12-544-3	for fluorescein slide
שלב מיקרוסקופ insert	מכשור מדעי יישומי	I-3017
מערכת חימום אובייקטיבית	Okolab		Oko Touch עם צווארון אובייקטיבי
שמן אובייקטיבי - סוג A	Nikon	discontinued
Plan Apo VC 100x 1.40 NA objective	Nikon	MRD01901
אשלגן כלורי	פישר	P217
אשלגן פוספט	Sigma-Aldrich	P0662
נתרן ביקרבונט	Sigma-Aldrich	S6297
נתרן כלורי	Sigma-Aldrich	S7653
משאבת מזרק	כלי מרווה	דגם 355
מתאם צינורות - נקבה	Small Parts Inc.	1005109
מתאם צינורות - זכר	Small Parts Inc.	1005012
צינורות טיגון	Bioptechs		מזהה 1/16 אינץ', עובי דופן 1/32 אינץ'<
מספריים קפיציים של Vannas	Fine Science Tools	15018-10

tr style='גובה:21px;'>