מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיית מורפולוגיה עצבית בגור עכבר

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים והווטרינר של JoVE לוח סקירה.

1. הכנת חלון גולגולת

1. להרדים את הגור באמצעות איזופלורן (1.0% - 2.0%) ולבדוק את רמת ההרדמה על ידי בדיקת צביטה בזנב.
2. פתח בזהירות את הגולגולת עם סכין גילוח מעוקר והשאיר את הדורה שלמה (קוטר 1 מ"מ) (איור 1C). השתמש בספוג ג'לטין (חתוך לחתיכות קטנות, כ-< 2 מ"מ3, בעזרת מספריים מעוקרים, והחל אותם באמצעות פינצטה) ספוג במאגר קליפת המוח (125 מילימול/ליטר NaCl, 5 מילימול/ליטר KCl, 10 ממול/ליטר גלוקוז, 10 מילימול/ליטר HEPES (4-(2-הידרוקסיאתיל)פיפרזין-1-חומצה אתנסולפונית), 2 מילימול/ליטר CaCl₂, and 2 mmol/L MgSO₄; pH 7.4; 300 mOsm/L; טמפרטורת החדר) כדי לעצור את הדימום. בעת פתיחת הגולגולת, השתמשו במאגר קליפת המוח כדי לשמור על לחות פני השטח.
3. בעזרת ספוג ג'לטין, הסר כל חיץ ודם מהמשטח הדוראלי. בעזרת קצות צהובים, יש למרוח שכבה דקה של 1.0% אגרוז בעל נקודת התכה נמוכה (מומס במאגר קליפת המוח). בעזרת מכונת בלוק חום, שמור על הטמפרטורה של תמיסת האגרוז על 42 מעלות צלזיוס עד ליישום.
   NOTE: ניקוז החיץ והדם חייב להתבצע מהצד של הגולגולת תוך הקפדה שספוג הג'לטין היבש לא יבוא במגע עם הדורה. אי ביצוע זה עלול לפגוע בדורה.
4. מרחו כיסוי זכוכית עגול (מס' 1, קוטר 3 מ"מ) על שכבת ג'ל האגרוז. הסר את כל הבועות בין הכיסוי לשכבת ג'ל האגרוז על ידי שפיכת עודף של ג'ל אגרוז ביניהן. הסר את עודפי הג'ל הבולטים מתחת לכיסוי באמצעות פינצטה (איור 1D ו-1E).
5. אבטח את הכיסוי באמצעות צמנט דנטלי (איור 1F).
6. מערבבים את אבקת המלט ונוזל המלט. מרחו את התערובת בעזרת טיפים צהובים לפני שהיא מתמצקת. אין למרוח מלט דנטלי על הדורה, מכיוון שהדבר עלול לפגוע במוח.
7. צרף סרגל טיטניום סטרילי (בהתאמה אישית, כ-30 מ"ג, ראה איור 1G) על עצם הגולגולת באמצעות מלט דנטלי. יישר את מוט הטיטניום ואת הכיסוי (על פני הדורה) במקביל כדי לצלם תמונות בקלות.
8. כסו את הגולגולת החשופה במלט דנטלי (איור 1H).
9. שחזר את הגור מההרדמה. שמור אותו על תנור חימום (37 מעלות צלזיוס) עד שהמלט הדנטלי יתמצק (שעה).

2. הדמיה דו-פוטונית

1. הגדר את אורך גל הלייזר של שני הפוטונים. לעירור RFP (חלבון פלואורסצנטי אדום), השתמש ב-1,000 ננומטר (450 mW/mm2 בעומק של 400 מיקרומטר).
   NOTE: עוצמת הלייזר יש להפחית ככל שמצב ה-z עולה למעלה.
2. נגב את פני הכיסוי עם 70% אתנול.
3. הרדמו את הגור באמצעות איזופלורן (1.5% - 2.0%) ובדקו את רמת ההרדמה באמצעות בדיקת צביטת זנב.
4. חבר את הגור לצלחת הטיטניום בשלב ההדמיה באמצעות פס טיטניום על ראשו של הגור (איור 2A ו-2B). כוונן את הראש כך שהכיסוי יהיה מקביל לעדשת המטרה באמצעות שלב הגוניומטר (איור 2B). שמור על טמפרטורת הגוף של הגור באמצעות כרית חימום (37 מעלות צלזיוס).
5. הגדר את ריכוז האיזופלורן ל-0.7% - 1.0%.
   NOTE: ריכוז איזופלורן גבוה מאוד עלול לגרום למוות בשוגג של הגור במהלך ההדמיה.
6. מקם את שלב ההדמיה מתחת לעדשת האובייקט (20X, NA 1.0) של מיקרוסקופ שני הפוטונים (איור 2B ו-2C).
7. מרחו טיפה אחת של מים על הכיסוי. השתמש באפי-פלואורסצנציה כדי לאתר את הנוירונים המסומנים בחלבון פלואורסצנטי באזור שבו נחשפה הדורה
8. רכוש תמונות z-stack במרווחים של 1.4 מיקרומטר. עבור הדמיית נוירונים בשכבה 4, הגדר את רוחב z ל-150 - 300 מיקרומטר כדי לדמות את כל המורפולוגיה הדנדריטית (איור 2D ו-2E). השתמש בסריקה איטית ובממוצע כדי לקבל תמונות ברורות המציגות את המורפולוגיה העצבית (בדרך כלל לוקח > 20 דקות לרכוש את כל המורפולוגיה הדנדריטית).
   NOTE: הפרמטרים הבאים מומלצים להדמיה. אורך גל עירור: 1,000 ננומטר, סורק: סוג גלוונומטר, מראה דיכרואית: 690 ננומטר, מסנן פליטה: פס פס 575 - 620 ננומטר, גלאי: סוג GaAsP, הגדרת רווח > 100, גודל תמונה > 512 x 512 מיקרומטר, שדה ראייה > 600 x 600 מיקרומטר, רזולוציית פיקסלים < 1.2 מיקרומטר.

איור 1: ניתוח, הכנת חלון הגולגולת והצמדת מוט הטיטניום. (A) לוח זה מציג את הסרת העור המכסה את הגולגולת. (B) לוח זה מציג את קיבוע הפער בין העור לגולגולת. היזהר לא להחיל את ההדבקה על אזור ההדמיה. (C) זהו דימוי של הדורה החשופה. סכין גילוח הוכנס בין הגולגולת לדורה, והגולגולת נפתחה משמאל לאזור החשוף (ראש החץ). לאחר מכן ניתן להסיר את העצם בקלות באמצעות מלקחיים. (D) זהו עיצוב סכמטי המציג מבט אנכי על חלון הגולגולת. הפער בין זכוכית הכיסוי לדורה מלא בשכבה דקה של ג'ל אגרוז. הכיסוי מקובע לגולגולת באמצעות מלט דנטלי. (E) כיסוי בצורת עגול מונח על שכבת ג'ל האגרוז. (F) זוהי תמונה של הכיסוי המאובטח. (G) לוח זה מציג את העיצוב של מוט הטיטניום. מוט הטיטניום מכיל שני חורי ברגים לחיבור לשלב ההדמיה (ראה איור 2) וחלק מלבני שטוח אחד המחובר לראש הגור. (H) החלק המלבני של מוט הטיטניום מחובר לגולגולת הגור באמצעות מלט דנטלי.

איור 2: in vivo{{}} דימות דו-פוטוני של תאי עצב בקליפת המוח בעכברים שזה עתה נולדו. (A) החלונית הזו מציגה את העיצוב של לוחית הטיטניום. ללוחית הטיטניום שני חורי ברגים לחיבור מוט הטיטניום וארבעה חורי בורג לחיבור שלב הגוניומטר, המונח על שלב ההדמיה. ברגים בגודל 2.5 מ"מ (בקוטר) x 2 מ"מ (באורך) משמשים לקיבוע. (B) זוהי תמונה מייצגת של הגור המחובר לשלב ההדמיה. טמפרטורת הגוף של הגור נשמרת באמצעות תנור חימום. (C) הגור מורדם באמצעות איזופלורן במהלך הליך ההדמיה in vivo. (D) פאנל זה מציג תמונה מייצגת של Z-stack זמן-lapse של נוירונים בקליפת המוח בשכבה 4 של גור P5. ראש החץ מציין את הנוירון עם דנדריטים מטושטשים, אותם יש להסיר מהניתוח. (E) פאנל זה מציג תמונות בהגדלה גבוהה יותר של תא העצב עם חיצים בפאנל D. ראשי חץ כחולים: קצות דנדריטיים הנסוגים תוך 4.5 שעות, ראשי חץ צהובים: קצות דנדריטיים המוארכים תוך 4.5 שעות, ראשי חץ לבנים קטנים: אקסון של תא שכן. (F) זהו מודל תלת-ממדי של העקבות הדנדריטיות של תא העצב באיור השמאלי של הפאנל E. עיגולים כחולים מציינים את מיקום גוף התא. (G) פאנל זה מציג נוירונים מייצגים עם דנדריטים מנותקים, שאינם נכללים בניתוח. הנתונים לדוגמה בפאנלים D - G מכילים נוירונים דפוקים של NR1 (תת-יחידה חיונית של קולטן גלוטמט מסוג NMDA) (בגלל נתונים מוגבלים הזמינים מהמחברים).