הדמיית ביולומינסנציה לחקר מעברי סידן במבני מוח של דרוזופילה

תקציר

מקור: Lark, A. R., et. al., In vivo Functional Brain Imaging Approach המבוסס על אינדיקטור סידן ביולומינסנט GFP-aequorin. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים הדמיה בזמן אמת של דינמיקת סידן באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק-aequorin bioluminescence ב Drosophila's מבני מוח עמוקים.

פרוטוקול

1. הדמיה

1. 1. הפעל את מערכת ההקלטה על ידי הפעלת המיקרוסקופ, המחשב, המצלמה ומערכת הניקוז והגדרת הבקרות הסביבתיות בחדר ל-25 מעלות צלזיוס.
   2. פתח את המדידה ו תוכנית סייר האוטומציה במחשב. לחץ על "התקנים וממשקים", לאחר מכן לחץ פעמיים על "NI Motion Devices", ולבסוף לחץ לחיצה ימנית על "PCI-7334" ובחר "אתחול התקן".
   3. פתח את Photon Imager. צור תיקיה חדשה ותן שם לקובץ ההקלטה הראשון. המצלמה חייבת להגיע ל-80 מעלות צלזיוס לפני שהמערכת תפעל.
   4. הגדר את מערכת הזילוף: הוסף KCl (אשלגן כלורי), ניקוטין ותמיסת רינגר למאגרים והתאם כך שכל תמיסה תתרוקן ב-2 מ"ל לדקה. שטפו עם התמיסה של רינגר לפני תחילת הניסוי.
2. הכן דגימה
   1. הנח את צלחת בלוק תושבת ההדמיה על התושבת מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 5 והכנס את צינור הזלוף לתעלה דרך הפנצ'ר.
   2. כוונו את המיקרוסקופ למצב פלואורסצנטי, ואז מרכזו והביאו את גופי הפטריות (MBs) למיקוד. התאם ל-20X, מרכז מחדש ומיקוד.
   3. מקם את מנגנון הניקוז מעל בריכת הניקוז, כוונן את גובה שאנט הניקוז כך שהקצה יהיה ממש מעל הבריכה, והפעל את הפתרון של רינגר למשך 30 שניות כדי להבטיח ניקוז נאות.
   4. משוך את המגן כלפי מטה כדי לאטום את המכשיר מאור. באמצעות המערכת האוטומטית בהדמיית הפוטון, בצע התאמות עדינות למיקוד וצלם תמונת פלואורסצנט ייחוס של ה-MBs.
3. } הקלטה
   1. התאם את מהירות הפוטון למהירות ההקלטה הרצויה (מ-50 אלפיות שנייה עד שנייה אחת או יותר). בחר במצב פוטון ופתח את התריס. רשום גנוטיפ, מין, גיל ומספר דגימה ברשומות יומן. התאם את המיקום של תיבות ROI (אזור עניין) מעל גביע וגופי תאים (CCB) ואונות מדיאליות על ידי לחיצה על תיבות ה-ROI וגרירה תוך כדי החזקת שליטה.
   2. הקלט את קו הבסיס למשך כ-5 עד 10 דקות (לפי הצורך).
   3. מרחו ניקוטין למשך דקה. שים לב להתחלה/עצירה ביומן. שטפו עם תמיסת רינגר למשך 5 דקות.
   4. המתינו 5 דקות להתאוששות והכינו את הזנת היומן והטיימר של KCl (אשלגן כלורי).
   5. יש למרוח KCl למשך דקה אחת. שים לב להתחלה/עצירה ביומן. שטפו עם תמיסת הצלצול למשך דקה אחת.
   6. עברו למצב פלואורסצנטי, קחו את התמונה הפלואורסצנטית הסופית וכבו את תמיסת הצלצול.
   7. לחץ על "עצור". תיבת דו-שיח תשאל אם ברצונך לכבות את המערכת. בחר "לא" כדי להמשיך בהקלטה.
   8. פתח את המגן, הזז את מערכת הניקוז, העבר את מטרת העדשה ל-5X והסר את צינור הזילוף. הסר את הדגימה/צלחת ההקלטה מה-stagה, ונקה את עדשת ה-20X על ידי שטיפה וניגוב העדשה פעמיים במים.
   9. לחץ על כפתור ההפעלה הלבן בחלק העליון של חלון התוכנית כדי להתחיל את ההקלטה הבאה.

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
נתרן כלורי<	S3014
Calcium chloride	Merck	1023911000
HEPES	Sigma-Aldrich	7365-45-9
אשלגן כלורי	Prolabo	26 764.298
מגנזיום כלוריד	Prolabo	25 108.295
Sucrose	Sigma-Aldrich	S0389
Nicotine	Sigma-Aldrich	N3876
ATP	Sigma-Aldrich	A2383	אדנוזין 5′-טריפוספט מלח דיסודיום הידרט
Benzyl-coelenterazine	Prolume, nanolight	Cat #301 Coelenterazine h	http://www.prolume.com/
טיפות פיפטה	Corning Incorporated	4868	100-1000μL Univesal Pipette Tip
EM-CCD camera	Andor	DU-897E-CS0-#BV	iXon (מקורר ל-80°C)
Microscope	Nikon	N/A	Eclipse-E800
Immersion objective lens	Nikon	N/A	20x Fluor .5w
dissection microscope with fluorescence	Leica MZ Fl III	N/A	leica dissection scope and florescent lamp
משאבה פריסטלטית	Gilson	N/A	Minipuls 2
Tubing	Fisher Scientific	תלוי בעובי	Tygon R3603, St-Gobain
Perfusion system	Warner	64-0135 (VC-66CS)	מערכת בקרת שסתום זלוף, שלמה, עם שסתומי צביטה, 6 ערוצים
regulators Perfusion	Leventon	201108	Dosi-flow 3
סייר המדידה והאוטומציה	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon imager	Science Wares & National Instruments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Photon viewer	Science Wares & National Instuments	N/A	software http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380
Excel	Microsoft	N/A	תוכנה https://www.microsoft.com
Virtual dub	open access	N/A	תוכנה http://virtualdub.sourceforge.net/

td style='גלישה:מוסתר;ריפוד:0px 3px;יישור אנכי:תחתון;רווח לבן:רגיל;גלישת מילים:break-word;אסטרטגיית גלישה:4;'>Sigma-Aldrich