אבלציה עצבית ממוקדת באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית בזחל דג זברה

תקציר

מקור: Muto, A., . אבלציה של אוכלוסייה עצבית באמצעות לייזר דו-פוטוני והערכתה באמצעות הדמיית סידן ורישום התנהגותי בזחלי דג זברה. J. Vis. exp. (2018)
}

} בסרטון זה, מודגם הליך אבלציה בלייזר דו-פוטוני, המאפשר הרס סלקטיבי של נוירונים פלואורסצנטיים בזחלי דג זברה משותקים באגרוז. הדמיה ברזולוציה גבוהה לפני ואחרי ההליך מאשרת נזק עצבי יעיל, כפי שנצפה בהיעדר פלואורסצנטיות.

פרוטוקול

1. אבלציה של תת-אוכלוסייה של נוירונים באמצעות מיקרוסקופ לייזר דו-פוטוני

1. התחל בהגדרת הזדווגות של קו Gal4 שמתייג נוירונים ספציפיים למחקר ו-UAS:EGFP או UAShspzGCaMP6s. הקפד להשתמש ברקע nacre עבור שני ההורים, כך שניתן יהיה להשיג הומוזיגוטים nacre ניתן יהיה להשיג הומוזיגוטים.
   הערה: הומוזיגוטים של nacre אינם מכילים מלנופורים על פני הגוף (איור 1B). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בקו Gal4 gSAIzGFFM119B (המסמן את הפרטקטום) ובקו Gal4 אחר hspGFFDMC76A (המסמן את ה-ILH (אונת ההיפותלמוס).

2. למחרת מערך ההזדווגות, אספו את ביצי דג הזברה, והרימו אותן לשלב הזחל שבו הנוירונים המעניינים יבטאו דיווחים פלואורסצנטיים.

3. הרכיבו את זחל דג הזברה ב-2% נקודת התכה נמוכה (איור 1B).

1. התחל בהכנת תמיסת מלאי אגרוז 2%: ממיסים 2 גרם אבקת אגרוז נמוכה במי מערכת של 100 מ"ל (כלומר, המים המשמשים לשמירה על דג זברה בוגר במערכת מים במחזור) או מי E3, על ידי הבאת המים לנקודת הרתיחה במיקרוגל, וערבוב נמרץ.

   1. מיקרוגל את ציר האגרוז בעל נקודת ההיתוך הנמוכה של 2% עד שהוא רותח. יוצקים 3.5-4.0 מ"ל מהאגרוז על מכסה צלחת פטרי בגודל 6 ס"מ. המתן עד שהאגרוז יתקרר כך שיהיה חם למגע לפני שתמשיך.

   2. לאחר מכן, הניחו זחל בודד (לא מורדם בשלב זה) באגרוז. המשיכו להתאים את המיקום והכיוון של הזחל כך שיהיה זקוף, באמצעות מחט חיתוך (איור 1C), עד שהאגרוז מתמצק כדי להבטיח את המיקום הנכון של הזחל.
      הערה: הזחל ימשיך לשחות בזמן שהאגרוז מתמצק.

   3. לאחר מיקום הזחל, אפשר 5 דקות עד שהאגרוז יתמצק לחלוטין.

   4. יוצקים 5 מ"ל של תמיסת טריקאין (0.4% בריכוז עבודה של 1x) על האגרוז.
      הערה: כדי למנוע תנועות של הזחלים במהלך אבלציה בלייזר, יש לשמור על הזחלים מורדמים לאורך כל הליך האבלציה.

4. כריתת הזחל באמצעות פונקציית ההלבנה במערכת מיקרוסקופ לייזר דו-פוטוני.

1. הנח את הזחל המוטבע באגרוז מתחת למיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני והפעל את מערכת המיקרוסקופיה.

2. הפעל את התוכנה לרכישת תמונות ולחץ על כפתור "מופעל" בכרטיסייה "לייזר" כדי להפעיל את הלייזר (איור 1D). המתן עד ש"מצב" הלייזר ישתנה מ"עסוק" ל"נעול מצב".

3. בכרטיסייה "ערוצים", הגדר את אורך הגל של הלייזר ל-880 ננומטר (הספק מרבי: כ-2,300 mW) עבור אבלציה של EGFP (חלבון פלואורסצנטי ירוק משופר), או ב-800 ננומטר (הספק מרבי: כ-2,600 mW) עבור אבלציה של GCaMP.

4. בחר את עדשת האובייקטיבית 20X על ידי הזזה ידנית של אקדח העדשה. לחץ על הכרטיסייה "אתר", לחץ על "GFP" (חלבון פלואורסצנטי ירוק) כדי לשנות את המסלולים האופטיים, ולהציג ישירות את הקרינה בעין.

5. אתר את מוח זחל דג הזברה במרכז התצוגה; ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה "רכישה" כדי לחזור למיקרוסקופ של שני פוטונים.

6. כתיעוד של מצב 'לפני האבלציה', צלם תמונת z-stack עם עדשת האובייקט 20X במהירות סריקה גבוהה (כדי למנוע נזקי חום). מאוחר יותר השוו את התמונות שצולמו לפני ואחרי ניסויי אבלציה (איור 2A). כדי להשיג z-stack, לחץ על "Z-Stack" כדי לבחור באפשרות z-stack ולהרחיב את הכרטיסייה. הגדר את הגבול התחתון (לחץ על כפתור "קבע תחילה") לאחר התמקדות בקצה הגחון של מוח הזחל, והגדר את הגבול העליון (לחץ על כפתור "קבע אחרון") לאחר התמקדות במשטח הגבי ביותר של המוח. לאחר מכן, לחץ על כפתור "התחל ניסוי" כדי להפעיל את רכישת התמונות z-stack.

7. בחר את עדשת האובייקט 63X על ידי הזזה ידנית של אקדח העדשה.

8. לחץ על הכרטיסייה "איתור" כדי לעבור למיקרוסקופיה אפי-פלואורסצנטית, אתר את התאים שיש לכרות במרכז הראייה על ידי העין, ולאחר מכן לחץ על הכרטיסייה "רכישה" כדי לחזור למיקרוסקופ סריקת לייזר.

5. בכרטיסייה 'מצב רכישה', הגדר את "גודל מסגרת" ל-256 x 256. לחץ על "חי" והתבונן בתאי העצב המעניינים.

6. החל מהצד הגבי ביותר, מצא מישור מוקד שבו התאים שיש לפרק נמצאים בפוקוס.

7. סמן אזור קטן ועגול כשליש מגודל התא בקוטר של כל נוירון כאזור עניין (ROI) באמצעות הפונקציה "Regions".

8. הגדר את מהירות הסריקה ל-13.93 שניות/256 x 256 פיקסלים (134.42 מיקרומטר x 134.42 מיקרומטר), המקביל לזמן שהייה בלייזר של כ-200 מיקרומטר/פיקסל, או 200 מיקרון/0.5 מיקרומטר. כמו כן, הגדר 4 חזרות ('מחזור איטרציה: 4'). לחלופין, מטב את מספר האיטרציות ומהירות הסריקה כך שתושג אבלציה מספקת.

9. בצע את פונקציית 'הלבנה' לאבלציה, בשילוב עם 'סדרת זמן (2 מחזורים)' כדי לדמות את הדגימה (לפני ואחרי האבלציה) ו'אזורים' (כדי להגדיר את ההחזר על ההשקעה) או פונקציות שוות ערך בתוכנה שבה נעשה שימוש (איור 1D).

10. על ידי השוואת התמונה הראשונה (לפני האבלציה) והתמונה השנייה (לאחר אבלציה) במחזור סדרת הזמן, ודא שלאחר ההלבנה, הקרינה בתאים הממוקדים יורדת לזו שנצפתה ברמת הרקע (איור 2B).

11. אם הקרינה עדיין קיימת לאחר האבלציה, הגדל את מספר האיטרציות.

12. לאחר מכן, הזז את מישור המוקד מעט עמוק יותר (כלומר<span style='font-family:Roboto; font-size:12.0pt;' lang='EN-US'>, לכיוון הצד הגחוני), ובחר את מישור המוקד הבא שבו מופיעים תאים לא מבוטלים.

13. בצע את פונקציית ההלבנה. חזור על שלבים אלה עד שכל התאים במבנה העצבי המעניין יבוטלו.

14. לאחר שעברנו על כל מישורי המוקד המכסים את המבנים העצביים שיש להסיר, בדקו את התאים לאיתור פלואורסצנטיות מבוטלת. אם נמצא כי תאים מסוימים עדיין פלואורסצנטיים עקב אבלציה לא מספקת, הקרין אותם שוב בלייזר כמתואר לעיל.

15. אם יש צורך לשחזר את הזחל מהאגרוז לאחר הקרנת לייזר, אל תנסה להוציא אותו בכוח מהאגרוז מכיוון שהדבר עלול לפגוע בזחל. במקום זאת, בצע בזהירות חתכים זעירים באגרוז סביב הזחל בניצב לפני השטח של גופו. לאחר מכן, המתן עד שהזחל ישחה החוצה מהאגרוז בכוחות עצמו כאשר חומר ההרדמה יתפוגג.

16. המשך לזחל הבא לאבלציה או בצע ניסויי בקרה באמצעות אוכלוסייה אחרת של נוירונים שאינם מעורבים בהתנהגות הנחקרת.
    הערה: כאן, כבקרה, נוירונים של פקעת הריח ב-UAS:EGFP; זחלי gSAIzGFFM119B עברו הסרה בלייזר באמצעות אותו פרוטוקול שתואר לעיל (איור 2A, מימין).

17. אפשר מספר שעות או יום אחד להתאוששות לפני שתמשיך להדמיית Ca או הקלטה התנהגותית. במהלך זמן התאוששות זה, בדוק את בריאות הזחל (i.e., שחייה ספונטנית רגילה, ללא נזקי חום נראים לעין סביב האזור המנותק, etc.) והסר זחלים המראים סימנים כלשהם של בריאות לקויה.

תוצאות

חומרים

רשימת החומרים שנעשה בהם שימוש במאמר זה

שם	חברה	מספר קטלוג	הערות
NuSieve GTG Agarose	Lonza	Cat.#50080	אגרוז טמפרטורת התכה נמוכה
6 cm petri dish	FALCON	Product#:351007
dissecting needle	AS ONE Corporation	חתול. מס' 2-013-01	https://keystone-lab.com/en/item/detail/404142
LSM7MP	Carl Zeiss		מיקרוסקופ סריקת לייזר דו-פוטוני
w plan-apochromat 63x/1.0	Carl Zeiss		עדשת אובייקטיבית 63X
Imager.Z1	Carl Zeiss		an epi-fluorescence microscope
ZEN	Carl Zeiss		תוכנה לרכישת תמונות למיקרוסקופים קונפוקליים
אטם תא היברידיזציה מאובטח, 8 תאים, קוטר 9 מ"מ x 0.8 מ"מ עומק	בדיקות מולקולריות	קטלוג # S-24732	משמש כתא הקלטה בהדמיית Ca
Imageing Chambers	Grace Bio-Labs	CoverWell Imaging Chambers PCI-A-2.5	משמש כתא הקלטה התנהגותי
סכין כירורגית	MANI	סכין עיניים MST15
ORCA-Flash4.0	Hamamatsu Photonics	דגם:C11440-22CU	מצלמת CMOS מדעית
HCImage	Hamamatsu Photonics		image acuisition software
מודול הקלטת דיסק קשיח	Hamamatsu Photonics		מודול תוכנה המאפשר שמירת קבצי הסרט בכונן דיסק קשיח בזמן קצר
SZX7	Olympus		stereoscope
DF PL 0.5X	Olympus		עדשה אובייקטיבית עבור SZX7
Point Grey Grasshopper3 4.1 MP Mono USB3 Visio	FLIR Systems, Inc.	Product No. GS3-U3-41C6NIR-C	CMOS camera
XIMEA xiQ camera	XIMEA	Product No. MQ042RG-CM	CMOS camera
נורת LED טבעת	CCS	דגם: LDR2-100SW2-LA	LED לבן
רשת ניילון 32 מיקרומטר	Tokyo Screen	N-No.380T	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/
רשת ניילון 13 מיקרומטר		N-No. 508T-K	http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20347/<
מתכת seive 150 מיקרון צמצם	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
מתכת seive 75 מיקרון צמצם	Tokyo Screen		http://www.tokyo-screen.com/cms/sta20341/#ami
EBIOS	Asahi Food & Healthcare, Co. Ltd.		Dry Beer yreserve
LabVIEW	National כלים		סביבת פיתוח משולבת לתכנות
Mai-tai HP	ספקטרום פיזיקה

tr style='height:21px;' >