מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיה In Vivo של מיקרו-כלי דם במוח העכבר

תקציר

Source: Nishimura, C. et al. כימות של ארכיטקטורת כלי דם מוחיים באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית במודל עכבר של דלקת עצבית הנגרמת על ידי HIV. J. Vis. Exp. (2016).

סרטון זה מדגים את ההדמיה in vivo של נימים בקליפת המוח במוח העכבר באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני. הוא מתאר את השלבים להזרקת צבע פלואורסצנטי לעכבר מורדם עם חלון קליפת המוח דק הגולגולת, הכנת ההתקנה להדמיה ורכישת תמונות מפורטות של מבנים מיקרו-וסקולריים במוח לניתוח.

פרוטוקול

כל ההליכים הקשורים למודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הזרקת הצבע הפלואורסצנטי

1. צובטים את עורו של עכבר מורדם על הירך השמאלית האמצעית באמצעות מלקחיים #5. משוך בעדינות את העור כלפי מעלה והשתמש במספריים כדי לחתוך ולהסיר את העור. הכן צבע רודמין מצומד פולט אדום דקסטרן (70 kDa) (10 מ"ג/ק"ג מומס במי מלח).
2. אתר את וריד הירך. בעזרת מזרק של 1 מ"ל עם מחט של 30 גרם מחוברת, צייר תמיסה שהוכנה בעבר של צבע פלואורסצנטי המתאים להדמיה לקו 130 מיקרוליטר של המזרק. הסר את כל בועות האוויר על ידי שאיבת הצבע לחלוטין לתוך המזרק ולחיצה חזקה על דופן המזרק.
   1. כופפו את מחט ה-30 גרם בזווית של כ-30 מעלות על ידי לחיצה על משטח קשיח עם צד משופע כלפי מעלה. מלאו את המחט בצבע והשליכו עודפי נוזלים, והשאירו דגימה של 100 מיקרוליטר.
3. הזרקו את דגימת הצבע של 100 מיקרוליטר לאט לווריד הירך. לאחר הסרת המחט, הפעל לחץ יציב ועדין על מקום ההזרקה כדי לעצור כל דימום. אפשר לצבע להסתובב במשך 5 דקות.
4. סגור את הירך השמאלית על ידי תפירת העור יחד עם תפר 4-0, ואז הפוך את העכבר בזהירות על הבטן שלו, והנח אותו ברתמת לוח הראש של העכבר.
   

2. in vivo} הדמיה דו-פוטונית

1. העבירו את המנגנון הכירורגי למיקרוסקופ של שני פוטונים, הקפדה על שמירה על רמות הרדמה רציפות. הנח כמות קטנה של 0.9% מי מלח לתוך מאגר לוחית הראש והורד את מטרת המיקרוסקופ כך שתבוא במגע עם מי המלח. אתר את אזור העניין באמצעות יעד הצפייה בשדה בהיר.
2. הגדר את עירור הלייזר הדו-פוטוני לאורך גל המתאים לצבע הפלורסנט. התחל הדמיה של שני פוטונים באמצעות המטרה 25x.
   שימו לב שבניסויים האלה השתמשנו בדקסטרן מצומד לצבע רודמין פולט אדום שנרגש באורך גל של 780 ננומטר. מסנן פליטת פס פס 607/36 שימש לזיהוי הקרינה מהצבע, ומסנן פליטת פס פס 480/20 שימש לזיהוי אוטופלואורסצנציה עורקית.
3. אתר מיטה נימית במסך התצוגה והגדל אזור זה באמצעות זום אופטי 2. רכוש תמונות של הנימים באמצעות תוכנת הדמיה דו-פוטונית.

חומרים