הדמיה פלואורסצנטית לכל החיים של צבירת חלבון PolyQ בנוירונים של Caenorhabditis elegans

1. רכישת נתוני FLIM

הערה: בפרוטוקול זה, אורך החיים של הפלואורופור נרכש באמצעות שיטת TCSPC בתחום הזמן. FLIM דורש פולס אור שייווצר על ידי הלייזר בקצב חזרה קבוע וקבוע. קצב החזרה משתנה בהתאם לסוג הלייזר וצריך להיות ידוע על ידי המשתמש. מדידות אורך חיים מושגות על ידי גלאים וציוד אלקטרוני המותקנים לצד מיקרוסקופ קונבנציונלי. בפרוטוקול זה, המדידות מבוצעות על שלושה מיקרוסקופים קונפוקליים שונים לסריקת לייזר עם גלאים ותוכנה המסופקים על ידי שתי חברות שונות ( טבלת חומרים) לרכישת אורך חיים של mRFP, CFP ו-YFP, בהתאמה. בדוק שמסנני הפליטה/עירור הנכונים נמצאים במקומם ומזער כל רקע או תאורת צג אחורית לפני שתתחיל. לפני שתתחיל בניסוי כלשהו, קבע את היציבות הפוטו-יציבות של הפלואורופור הנבחר. אם הפלואורופור מלבין תוך זמן קצר בתוך רקמות הנמטודה, הוא לא מתאים למדידות FLIM בC. elegans.

1. פתח את תוכנת הרכישה של FLIM. תוכנת FLIM מאפשרת גם שליטה במיקרוסקופ הקונפוקלי. אתר את הכרטיסייה/כפתור כדי לאפשר את הפעלת הפלטים של הגלאי ולחץ על אפשר פלטים.
2. רכוש את פונקציית תגובת המכשיר (IRF), המתארת את דיוק התזמון של המערך האינסטרומנטלי.
   הערה: רצוי לבצע שלב זה לפני הרכבת הנמטודות.
   1. אם זמין, הסר את מסנני העירור/פליטה.
   2. הנח כיסוי ריק מעל המטרה ומצא את פני השטח שלו. רשום את אות הפיזור המתקבל מהחלקה למשך 30 שניות לפחות.
      } הערה: עבור אורך חיים של מספר ננו-שניות, תוכנת הרכישה יכולה להעריך אוטומטית את היסט ה-IRF. רכישת IRF מומלצת תמיד.
3. הניחו את השקופית עם C. elegans על הבמה. שימוש בעדשת הגדלה פי 10 במצב שידור ומיקום מיקום הנמטודות בשקופית.
4. הסר את השקופית, העבר את המטרה לעדשת הגדלה פי 63 והחל את מדיום הטבילה הנדרש (למשל, שמן). החלף את השקופית על הבמה ומקם את הנמטודות.
5. אתר את Pinhole Manager בתוכנת הרכישה ופתח אותו ל מקסימום. התחל לסרוק את הדגימה, בחר אזור עניין (למשל, ראש, פלג גוף עליון), והתמקד במישור ההקרנה המרבי שלה.
6. עקוב אחר קצב דופק הלייזר ושלושת הערכים האחרים הקיימים בממשק התוכנה: מפלה שברים קבועים (CFD), זמן למשרעת (TAC), ו}ממיר אנלוגי לדיגיטלי (ADC).
   הערה: הלייזר צריך להיות בעל שער מקסימלי של 1 x 10⁸ ספירת פוטונים בודדים. מספר זה מייצג את המספר המרבי של פוטונים המסופקים על ידי הלייזר. ה-CFD מספק מידע על קבלת דופק הפוטון הבודד בהתייחס לפולס הלייזר על ידי הגלאי. ערך זה צריך להיות בערך 1 x 10⁵. ה-TAC מבחין בין הזמן שבו זוהה פוטון אחד לבין פולס הלייזר הבא. לבסוף, ה-ADC ממיר את מתח ה-TAC לאות זיכרון הניתן לאחסון. ל-CFD, TAC ו-ADC צריכים להיות ערכים דומים כדי להבטיח שפוטונים הנפלטים על ידי הפלואורופור לא יאבדו. הערכה נכונה של פרמטרים אלה מבטיחה שנאספים מספיק פוטונים כדי ליצור מפת חיים מדויקת.
7. בממשק של תוכנת FLIM, תצוגה מקדימה של מספר הפוטונים שזוהו: ערך ה-ADC צריך להיות בין 1 x 10⁴ ו-1 x 10⁵. במידת הצורך, העבר את המיקוד למישור אחר או הגדל את עוצמת הלייזר כדי לאסוף יותר פוטונים.
   הערה: באופן כללי, מספר הפוטונים המוקלטים בשנייה לא יעלה על 1% מקצב החזרות של הלייזר.
8. בשורת התפריטים, בחר בכרטיסייה כדי להגדיר את פרמטרי הרכישה. בחר לסנכרן ב כדי לאפשר זיהוי פוטון בודד.
9. הגדר את הרכישה לפרק זמן קבוע או למספר קבוע של פוטונים. לדוגמה, רכוש עקומת דעיכה לכל החיים למשך 2 דקות או עד שפיקסל בודד יגיע לספירת פוטונים של 2,000 אירועים בודדים. לחץ על } התחל כדי להתחיל ברכישה.
   הערה: פלואורופורים שונים ידרשו לייזרים ומסננים שונים של עירור ופליטה. על פי בהירות המדגם, ניתן לכוונן גם את עוצמת הלייזר, מה שלא יפריע לאורך החיים. פרוטוקולים אלה משתמשים בהגדרות העירור/פליטה הבאות: YFP ex500/em520-50 ננומטר, mRFP ex561/em580-620 ננומטר. לייזר דו-פוטוני פועם שימש למדידות CFP באמצעות ex800/em440 ננומטר. כמות הזמן וספירת הפוטונים הנדרשים לרכישת מפת FLIM יצטרכו להיקבע באופן אמפירי עבור כל הגדרה וכל מטרת ניסוי.

2. ניתוח נתוני FLIM באמצעות תוכנת FLIMfit

הערה: בצע ניתוח נתונים באמצעות כלי התוכנה FLIMfit שפותח באימפריאל קולג' בלונדון (ראה איור 1}).

1. פתח את התוכנה וייבא קבצי נתונים של FLIM באמצעות קובץ | טען נתוני FLIM. טען את כל הדגימות ממצב אחד, גם אם הושגו במפגשים שונים ומחזרות ביולוגיות שונות.
2. במידת הצורך, פלח נמטודה בודדת מכל תמונת FLIM באמצעות סגמנטציה | מנהל סגמנטציה. גרור את כלי החיתוך סביב אזור העניין עד שהוא מסומן. לאחר שתסיימו, לחצו על OK.
   הערה: יש לבצע סגמנטציה עבור כל התמונות.
3. בחרו אזור קטן שבו TAG_296 מופיעה התמונה מבוססת העוצמה של C. elegans{{}}{{}}{{TAG_299 TAG_300}}, חצים 1). עקומת הדעיכה של אזור זה תופיע בחלון הדעיכה הגדול בצד ימין של הממשק (} איור 1, חץ 2).
   הערה: ניתן להציג את הדעיכה באופן ליניארי או לוגריתמי.
4. הגדר את הפרמטרים הנכונים כדי להעריך את אורך החיים באמצעות האלגוריתם של התוכנה כמתואר בשלבים 2.5-2.8.
5. בכרטיסייה {{}}} (} איור 1, חץ 3):
   1. {{}}הגדר ערך מינימום משולב TAG_349 TAG_348 TAG_347} כדי לא לכלול פיקסלים עמומים מכדי לייצר ערך התאמה טובה. בהתאם לדגימה C. elegans ערך זה משתנה בין 40-300. הזן ערכים שונים עד להשגת תצוגה מקדימה משביעת רצון.
   2. בחר מספר זמן מינימום} ומספר {{}} כדי להגביל את אות FLIM לערכים אלה. כל האירועים המופיעים לפני ואחרי סף זה לא ייכללו.
      הערה: לדוגמה, לניתוח של mRFP, האירועים שלפני 800 ps ואחרי 4,000 ps לא נכללו. ערכים אלה תלויים באורך החיים של הפלואורופור וצריכים להיקבע על ידי משתמש הקצה.
   3. אל תשנה את הקביעה המוגדרת מראש Counts/Photon מתוך 1.
   4. הזן את קצב חזרות, במגה-הרץ, של הלייזר שנעשה בו שימוש במהלך הרכישה.
      הערה: עבור הפרוטוקול הנוכחי, נעשה שימוש בלייזרים שונים עם קצבי חזרות שונים. לייזר שני הפוטונים המשמש לרכישת אורך חיים של CFP הוא בעל קצב חזרות של 80 מגה-הרץ, עבור YFP הלייזר חוזר על עצמו ב-40 מגה-הרץ, ועבור mRFP הערך הוא 78.01 מגה-הרץ. ערכים אלה הוזנו ל-FLIMfit על פי המדגם שנותח.
   5. הזן ערך Gate Max כדי לא לכלול את כל הפיקסלים הרוויים.
      הערה: עבור מדידות לכל החיים בC. elegans}, ערך זה מוגדר לכל מספר גדול (למשל, 1 x 10⁸).
6. בלשונית אורך חיים, בחר התאמה גלובלית לשימוש (למשל, התאמה מבחינת פיקסלים). ראה } איור 1, חץ 4.
   הערה: A } פיקסלים} תייצר דעיכה המותאמת לכל פיקסל בנפרד. התאמת }Image-wise} תייצר התאמה גלובלית של כל תמונה בנפרד ותציג ערך אורך חיים יחיד לכל תמונה. התאמה Global-wise תייצר התאמה אחת בכל מערך הנתונים. ערך כולל יחיד מסופק עבור כל התמונות.
7. אל תשנה שום פרמטר אחר מלבד No. Exp אם ידוע שדעיכת הקרינה שנבחרה היא רב-מעריכית ומציגה יותר מתקופת חיים אחת.
   הערה: בפרוטוקול הנוכחי, פונקציה זו שימשה לחישוב אורך החיים של פלואורופור CFP דו-מעריכי.
8. העלה את ה-IRF דרך תפריט ה-IRF: IRF | טען IRF. כדי להעריך את משמרת ה-IRF, בחר IRF | הערכת משמרת IRF. קבוצת ערכים תופיע באופן אוטומטי בלשונית IRF. לאחר קביעת זה, אל תשנה פרמטרים אחרים בכרטיסייה זו.
9. } לאחר הגדרת כל הפרמטרים, לחץ על {{}} התאם מערך נתונים (} איור 1, חץ 5). האלגוריתם יפיק התאמה לעקומת הדעיכה ויקבע ערך אורך חיים לכל תמונה.
   הערה: ההתאמה המתקבלת, המודגשת בקו כחול, צריכה להיות חופפת לכל האירועים. התאמה טובה מתקבלת כאשר כל האירועים מיושרים לאורך ההתאמה.
10. לחץ על הכרטיסייה פרמטרים (} איור 1, חץ 6), הממוקם בתוך התפריטים הימניים העליונים של ממשק התוכנה, ובחר } סטטיסטיקה: w_mean (ממוצע משוקלל)} ובדוק ש-chi2{{ TAG_598}} קרוב ככל האפשר לערך 1.
    הערה: chi2{{}} קרוב לאחד מבטיח את דיוק ההתאמה. הערך הכולל של התמונה שנבחרה מתגלה כ-tau_1.
11. ייצוא כל מידע שמעניין אתכם: קובץ | ייצוא תמונות עוצמתיות/התאמת טבלת תוצאות/תמונות/היסטוגרמות. שמור את הגדרות הנתונים המשמשות לחישוב אורך החיים: קובץ | שמירת הגדרות נתונים.
    הערה: הפרמטרים שבהם נעשה שימוש יישמרו לניתוח עתידי של הדגימות שנבחרו.

3. ייצוגים גרפיים של נתוני FLIM

הערה: ניתן לייצג חזותית את תקופות החיים שנאספו מדגימות שונות בדרכים שונות. בחר כדי לציין את ערכי אורך החיים בננו-שניות או בפיקו-שניות.

1. הצג את איכות ההתאמה ואת הדיוק של העקומה על ידי ייצוא עקומת הדעיכה ישירות מ-FLIMfit.
2. ייצג את התפלגות הפוטונים על ידי התוויית תדירות ספירת הפוטונים לעומת ערך אורך החיים בהיסטוגרמה.
3. לבסוף, לצורך השוואה סטטיסטית, אם משווים שתי דוגמאות או יותר, מקם ערכי אורך חיים בתוספת סטיית תקן של הממוצע בגרף עמודות של תרשים פיזור. בצע כל ניתוח סטטיסטי רצוי.