הדמיה של פקקת מוחית בעכבר באמצעות הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת

Abstract

מקור: Kim, D., et. al. הדמיה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום וטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת להדמיה ישירה של טרומבואמבולי מוחי. J. Vis. Exp. (2016)

סרטון זה מדגים הדמיה של פקקת מוחית בעכברים באמצעות הדמיית טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (מיקרו-CT). מודל של עכבר פקקת מוח מוזרק עם ננו-חלקיקי זהב ממוקדי פיברין הפועלים כחומר מנוגד. העכבר מונח על מצע של מכונת מיקרו-CT, והתמונות מתקבלות מזוויות מרובות. באמצעות תוכנה מתאימה, התמונות משוחזרות ומעובדות.

Protocol

כל ההליכים הכוללים מודלים של בעלי חיים נבדקו על ידי הוועדה המוסדית המקומית לטיפול בבעלי חיים ומועצת הביקורת הווטרינרית של JoVE.

1. הכנת קריש שנוצר באופן אקסוגני המסומן בסמן פלואורסצנטי (איור 1)

1. הרדמה של עכבר בתא אינדוקציה באמצעות 3% איזופלורן מעורבב עם 30% חמצן (1.5 ליטר/דקה 100% חמצן). הקפידו על עומק הרדמה הולם על ידי התבוננות בטונוס השרירים ואישור היעדר רפלקס צביטת הבוהן.
2. הניחו את החיה על וילון סטרילי במצב נוטה ושמרו אותה תחת הרדמה באמצעות מסכת אינהלציה ואיזופלורן 2% מעורבב עם 30% חמצן. בצע את ההליכים הבאים באמצעות טכניקות אספטיות וחלוקים/מסכות/כפפות/מכשירים סטריליים. שמור על תנאים סטריליים על ידי ניקוי וחיטוי אזור הניסוי ב-70% אלכוהול לפני ואחרי ההליכים.
3. אסוף כ -300 ~ 1,000 מיקרוליטר של דם עורקי לאחר ניקור לב. מערבבים 70 מיקרוליטר דם מלא עם בדיקה C15 של 30 מיקרוליטר (ריכוז של 20 מיקרומול/ליטר), בדיקה פלואורסצנטית Cy5.5 רגישה לפעילות הצלבת פיברין של אנזים קרישה מופעל של גורם XIII (FXIIIa), כדי לסמן את הקריש באופן פלואורסצנטי (איור 1A). יש להזריק את הדם המעורב באמצעות מזרק של 3 מ"ל (מחט בקוטר 23) לתוך שפופרת פוליאתילן באורך 20 ס"מ (PE-50, תעודת זהות 0.58 מ"מ). יש לעקר צינורות PE (או לאשר סטרילי על ידי היצרן), ולהכין את הקרישים באופן אספטי במכסה המנוע של תרבית רקמות.
4. ודא את מותו של בעל החיים על ידי התבוננות בחוסר נשימה ודופק לב.
5. השאירו את הצינור העמוס בדם בטמפרטורת החדר למשך שעתיים, ולאחר מכן בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס למשך 22 שעות, ובצעו את ההליכים הבאים, כפי שדווח קודם לכן.
6. חותכים את הצינור המכיל פקקת לחתיכות באורך 1.5 ס"מ. בעזרת מזרק של 3 מ"ל מלא בתמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS), יש להוציא פקקת על צלחת המכילה PBS עם 6 בארות על ידי הזרקה עדינה של PBS לכל פיסת צינור. שטפו את הפקק שלוש פעמים עם PBS ( איור 1B).
7. טען את החלק הקצה הדיסטלי של צינור PE-10 באורך 15 ס"מ (מזהה 0.28 מ"מ) בפקקת באורך 1.5 ס"מ על ידי משיכה זהירה של הפקק השטוף, תוך הימנעות מבועות אוויר, באמצעות מזרק מלא במי מלח של 1 מ"ל עם מחט בגודל 30 המוחדרת לקצה הפרוקסימלי של הצינור.
8. חבר את צינור ה-PE-10 הטעון בפקקת עם צינור PE-50 באורך 3 ס"מ (תעודת זהות 0.58 מ"מ) ששונה כך שיהיה לו קצה מחודד (מזהה 200 מיקרומטר), אשר יונח על עורק המוח האמצעי (MCA) - אזור ההסתעפות של עורק המוח הקדמי (ACA) של עורק הצוואר הפנימי (ICA) במודל עכבר של שבץ תסחיף (איור 1C).

2. מידול מודל עכבר של שבץ טרומבואמבולי (איור 2)

1. להרדים עכבר אחר כדי ללטף אותו בתא אינדוקציה באמצעות 3% איזופלורן מעורבב עם 30% חמצן (1.5 ליטר לדקה). יש להזריק מלוקסיקם (5 מ"ג/ק"ג) תת עורית כדי להקל על כאבים לאחר הניתוח. הקפידו על עומק הרדמה הולם על ידי התבוננות בטונוס השרירים ואישור היעדר רפלקס צביטת הבוהן.
2. יש למרוח כמות קטנה של משחה וטרינרית על כל עין כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה. בצע את ההליכים הכירורגיים הבאים באמצעות טכניקות אספטיות וחלוקים/מסכות/כפפות/מכשירים סטריליים. שמור על תנאים סטריליים על ידי ניקוי וחיטוי אזור הניתוח ב-70% אלכוהול לפני, במהלך ואחרי הניתוח.
3. הזז את העכבר לשולחן ניתוחים. הניחו את החיה על וילון סטרילי במצב נוטה והשאירו אותה תחת הרדמה באמצעות מסכת שאיפה ואיזופלורן 2%. לאחר מכן, מהדקים את טמפרטורת הגוף ב-36.5 מעלות צלזיוס באמצעות שמיכה הומותרמית עם משוב ממדחום רקטלי.
4. לאחר הכנה כירורגית עם בטדין ו-70% אלכוהול, בצע חתך אנכי של 1 ס"מ באמצעות אזמל על הקרקפת בין האוזן השמאלית לעין. הדביקו את הקצה הדיסטלי של הסיב האופטי של מד זרימה דופלר לייזר על משטח העצם הטמפורלי השמאלי החשוף (1 מ"מ שמאל ו-4 מ"מ מתחת לברגמה). לאחר מכן, התחל ניטור זרימת דופלר (איור 2A).
5. הניחו את החיה. יישר את הצוואר על ידי משיכת השן הקדמית העליונה עם חוט המחובר לסיכה, וגלח את אזור הצוואר. לאחר מכן, בצע חתך אנכי בקו האמצע של 3 ס"מ, פתח אותו וחשוף את אזור נורת הצוואר השמאלית על ידי ניתוח רקמות רכות סביב כלי הדם. היזהר לא לפגוע בעצב הנרתיק.
6. קשרו את עורק הצוואר המשותף הפרוקסימלי השמאלי (CCA) באמצעות תפר משי שחור סטרילי 6-0, וקשרו את ה-ICA השמאלי ואת עורק הפטריגופלטין השמאלי (PPA) באמצעות תפרי משי שחורים סטריליים 7-0.
7. צרבו את עורק בלוטת התריס העליון השמאלי, שהוא ענף של עורק הצוואר החיצוני השמאלי, באמצעות צריבה חשמלית חד קוטבית, וקשרו את עורק הצוואר החיצוני הפרוקסימלי השמאלי (ECA) באופן רופף ואת האתר הדיסטלי יותר בחוזקה באמצעות תפרי משי שחורים סטריליים 7-0.
8. בעזרת מיקרו-מספריים יוצרים חור קטן (בקוטר של כ-0.2 ~ 0.25 מיקרומטר) בין האתרים הקשורים של ה-ECA.
9. הכנס את הצנתר המכיל פקקת לתוך החור ב-ECA תוך שחרור קשירת ה-ECA הפרוקסימלית. הדק שוב את קשירת ה-ECA הפרוקסימלי לאחר קידום הצנתר לתוך ה-CCA על מנת להצמיד את הקטטר למקומו.
10. צריבה כדי לחתוך את החלק הדיסטלי של ה-ECA, שהוא דיסטלי לאתר הקשירה הדיסטלי, וסובב את ה-ECA הפרוקסימלי החופשי בכיוון השעון כדי ליישר אותו לכיוון ה-ICA תוך הוצאת הקטטר מה-CCA. לאחר מכן, קדם את הצנתר כ-9 מ"מ לתוך אזור ההסתעפות MCA-ACA של ה-ICA הדיסטלי מיד לאחר שחרור קשירת ה-ICA. לאחר מכן, הדק את קשירת ה-ICA.
11. הנח את הפקקת לאזור ההסתעפות על ידי לחיצה עדינה על המזרק 1 מ"ל כדי להזריק את הפקקת. בדקו את הירידה בזרימת הדם המוחי של דופלר (CBF), שאמורה להיות נמוכה ב-30% או פחות בהשוואה לנקודת ההתחלה, אם הפקקת הצליחה לחסום את כלי הדם (איור 2B).
12. הסר את הקטטר וקשר את האתר הפרוקסימלי של ECA מיד ובחוזקה. בנוסף, שחרר את ה-CCA ואת ה-PPA.
13. סגור את מקום החתך באמצעות 6-0 תפרי משי. הפסקת ההרדמה לאחר המשך ניטור הדופלר לאורך פרק זמן נדרש (כאן, למשך 30 דקות לאחר הזרקת פקקת). החזר את העכבר לכלוב ריק ושמור אותו חם עם מנורת חימום. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא צבר הכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה.

3. in vivo} הדמיית מיקרו-CT של פקקת מוחית (איור 3)

1. הרדמה מחדש של העכבר עם איזופלורן של 2% כמתואר בשלב 2.1 בנקודת זמן מוגדרת מראש (כאן, שעה) לאחר תחילת שבץ תסחיף עקב מיקום הפקקת בעורק המוח. הקפידו על עומק הרדמה הולם על ידי אישור היעדר רפלקס צביטת הבוהן. יש למרוח כמות קטנה של משחה וטרינרית על כל עין כדי למנוע יובש בזמן ההרדמה.
2. השעו מחדש ננו-חלקיקי זהב ממוקדי פיברין (fib-GC-AuNP4) בריכוז של 10 מ"ג Au/ml ב-10 מ"מ PBS, וסוניקציה של חומר הדמיית הפקקת למשך 30 דקות כדי להבטיח פירוק ופיזור של הננו-חלקיקים. יש להזריק 300 מיקרוליטר fib-GC-AuNP (10 מ"ג/מ"ל) לווריד הפין.
3. הניחו את החיה על מיטה של מכשיר מיקרו-CT, ויישרו את הצוואר על ידי משיכת השן הקדמית העליונה עם חוט המחובר לסיכה כדי להפחית את חפצי התנועה.
4. 5 דקות לאחר הזרקת fib-GC-AuNP, התחל לקבל תמונות מיקרו-CT של המוח. עבור הניסויים המתוארים כאן, השתמש בפרמטרי ההדמיה הבאים: 65 kVp, 60 μA, 26.7 x 26.7 x 27.9 mm³ שדה ראייה, 0.053 x 0.053 x 0.054 מ"מ³ גודל ווקסל, 100 מילישניות למסגרת, ממוצע אחד, 360 צפיות, מטריצת שחזור 512 x 512, 600 פרוסות, זמן סריקה של 64 שניות.
5. החזר את העכבר לכלוב ריק ושמור אותו חם עם מנורת חימום. אל תשאיר את העכבר ללא השגחה עד שהוא צבר הכרה מספקת כדי לשמור על שכיבה עצם החזה.
6. המירו את נתוני התמונה הגולמית לפורמט Digital Imaging and Communications in Medicine (DICOM) באמצעות הפקודה 'Start' של החלונית 'Reconstruction' בחבילת תוכנה המותקנת על סורק המיקרו-CT.
7. לניתוחים כמותיים של התמונות (בשלב 6), המירו את נתוני DICOM לפורמט TIFF באמצעות חבילת תוכנה זמינה מסחרית בהתאם להוראות היצרן.
8. לניתוחים איכותיים כמו גם ניתוחים כמותיים בצורה פשוטה ומהירה יותר, השתמש בחבילת התוכנה ובתמונות המקוריות בעובי 0.054 מ"מ בפורמט DICOM ליצירת קבוצה חדשה של תמונות ציריות ועטרה המעובדות בעובי של 1 או 2 מ"מ (כאן, 2 מ"מ), כדלקמן.
   1. בחר את תיקיית DICOM בעץ 'Data Source', לחץ על לחצן העכבר הימני וייבא את התיקיה ל-'MasterDB' או 'PrivateDB'.
   2. לחץ על 'MasterDB' או 'PrivateDB' בעץ 'מקור נתונים', ובחר את התיקייה המיובאת. לאחר לחיצה על הכרטיסייה 'תלת מימד' בחלונית השמאלית ביותר, כאשר חלון 'אפשרויות טעינה' צץ, לחץ על 'OK' כדי לייבא רצף תמונות בתיקייה כערימה.
   3. שנה את ייצוג התמונה לפורמט הקרנה בעוצמה מקסימלית (MIP) על ידי לחיצה על המילה 'MRP' בחלונות התמונה הצירית והעטרה ובחירה 'MIP' בתפריט הקופץ. לאחר מכן, שנה את עובי התמונה ל-2 מ"מ לאחר לחיצה על 'TH : 0 [mm]' באותו חלון.
   4. באמצעות סרגל הניווט התלת-ממדי ברוחב 2 מ"מ המאפשר לחקור ערימת תמונות ולחתוך אותה בזווית ובמיקום מתאימים, הכן תמונת חתך צירי בעובי 2 מ"מ עם כיסוי מלא של מעגל וויליס (COW), המכיל פקקת. לחץ על כפתור הצילום (סמל המצלמה) בחלונית 'Output'. שמור את התמונה בתבנית TIFF.
9. לאחר מכן, הכינו חמש תמונות חתך עטרה בעובי 2 מ"מ המכסות ברציפות מהאונה הקדמית למוח הקטן.
   1. ראשית, הכן את הפרוסה השנייה על ידי יישור זהיר של מוט הנווט על התמונה הצירית כך שהתמונה העטרתית תוכל לדמיין בצורה הטובה ביותר את פקקת MCA-ACA.

לאחר מכן, הכינו את ארבע הפרוסות האחרות בצורה רציפה. לחץ על כפתור הצילום (סמל המצלמה) בחלונית 'Output'. שמור את התמונות בפורמט TIFF.

Results

איור 1: סקירה כללית של הכנת קריש דם עם תווית פלואורסצנטית. (A) ערבוב של דם מלא טרי עם בדיקה פלואורסצנטית קרובה לאינפרא אדום (NIRF) Cy5.5 (C15) המקושרת קוולנטית לגדילי הפיברין של הפקקת על ידי פעולה אנזימטית צולבת פיברין של גורם קרישה מופעל XI...

Materials